氮素循环是自然生态系统中的一种重要的物质循环过程，是由微生物代谢驱动的多种生物化学反应所组成^[1]。一直以来，反硝化过程(Denitrification)被认为是生态系统中无机氮去除的唯一生物地球化学途径。1977年，理论化学家Broda通过热力学定律推导得出在没有O₂参与的情况下，NH₄⁺能被NO₃^–或者NO₂^–氧化生成N₂，并预测自然环境中存在驱动该反应发生的微生物^[2]。直到1995年，Delft大学的研究者在一个厌氧反应器里发现NH₄⁺和NO₂^–会同时减小并产生N₂的现象，首次证实了厌氧氨氧化过程(Anaerobic Ammonium Oxidation, 简称Anammox)的存在^[3]。Anammox过程被证实后，科学家们对参与Anammox过程的细菌的种类、生理特性及其基因组结构进行了深入研究^[4-7]。2002年，有研究指出在海洋生态系统中Anammox过程贡献了24%–60%的N₂产量^[8]，说明了在自然环境中Anammox过程对氮循环有着重要的作用。大量研究表明，厌氧氨氧化细菌(Anammoxers)在多种类型生态系统的缺氧环境中都有广泛分布，如海洋生态系统^[9]、淡水生态系统^[10]和陆地生态系统^[11]。另外，在极端的生态环境中也发现了Anammoxers的存在，如热液喷泉口^[12]、高盐盆地^[13]、海冰^[14]、多年冻土^[15]和油田^[16]等。

Anammox是氮循环过程中一个重要的氮素去除的途径，是在厌氧条件下以NO₂^–为电子受体氧化NH₄⁺直接反应生成N₂的过程。在工程应用上，由于Anammox过程可以节省60%的O₂消耗量，减少90%的污泥产量且不需要有机物作为电子供体，所以目前在全球范围内Anammox已经发展成为一种高效节能的脱氮工艺，广泛应用于全球110多个污水处理厂^[7]。然而驱动Anammox反应的细菌目前还不能纯培养，因此目前研究Anammox过程主要依赖分子生物学方法，利用基因测序手段，从基因层面去分析其多样性以及与环境因素的关系。有关Anammox反应过程的化学计量方程首次在1998年被提出，并在2014年通过对高度富集培养的Anammoxers的研究进行了重新修订^[4]：

基于16S rRNA基因序列的相似性分析，Anammoxers在系统进化上隶属于浮霉状菌门(Planctomycete)^[17]，主要包括5个属，分别是Ca. Kuenenia，Ca. Brocadia，Ca. Anammoxoglobus，Ca. Jettenia和Ca. Scalindua (Ca.为Candidatus的简写)。其中Ca. Brocadia、Ca. Kuenenia和Ca. Anammoxoglobus一般在淡水生态系统中被发现^[18]，而Ca. Scalindua通常在高盐度的环境中为优势属^[19]，同时也有部分Ca. Scalindua种群在淡水环境中被发现，如污水处理厂^[20]和水稻土^[21]，说明Ca. Scalindua的分布同时会受盐度以外的其它环境因素的影响。已有研究表明，Ca. Jettenia caeni的活性即使在盐度很低的环境中也会受到抑制^[22]。另外Ca. Brocadia sinica倾向于在较高浓度NH₄⁺和NO₂^–的环境中存在，因为它对NH₄⁺和NO₂^–有较高的亲和力^[34]。以上研究表明，这5个属的Anammoxers在不同生态环境中有不同的多样性分布特点。然而先前Anammoxers多样性分布的研究都是各自独立的分析，都是以单一类型生境作为研究的区域，而对于地球生态系统当中不同类型生境之间Anammoxers多样性的总体分布特征尚不清晰。本研究基于对NCBI数据库已有的Anammoxers的16S rRNA基因序列，综合分析了不同类型生境中Anammoxers的多样性分布特征，并揭示环境主导因素对不同类型生境中Anammoxers的系统演化的作用以及与Anammoxers种群结构之间的关系。

1 材料和方法 1.1 数据收集与整理

本研究收集了近20年来发表的与Anammoxers在不同生境中多样性分布研究的相关文献，根据文献中公布的Anammoxers的16S rRNA基因的序列号(部分序列直接来自数据库)，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因数据库中下载相关基因序列。总共收集了12614条序列，这些序列来自全球不同的研究区域和不同类型的生境。根据相应文献中的具体采样点把这些序列分成八个典型生境类型(不同生境的参考文献见附件)，分别为海洋生境(Marine habitat)(南海、氧气最小层、太平洋、渤海、Okhotsk海、纳米比亚上升流、海绵以及深海热液等，共计参考21篇文献)，淡水生境(Freshwater habitat)(东江、Tanganyika湖、Rassnitzer湖、Kitanra湖、高山湖、太湖、新义河、Grany河、钱塘江等，共计参考17篇文献)，河口生境(Estuarine habitat)(包括日本海、Chesapeake Bay、珠江口、长江口、胶州湾以及Cape Fear河口等，共计参考14篇文献)，农业土壤生境(Agriculture soil habitat)(包括水稻土、森林土、根际土、含水土层、农业土壤等，参考15篇文献)，湿地生境(Wetland habitat)(滨海湿地、城市湿地、河岸带、盐沼湿地、红树林湿地、自然保护区湿地、人工湿地，共计参考10篇文献)，反应器生境(Reactor habitat)(包括多种类型的废水生物反应器，共计参考文献32篇)，污水厂生境(WWTP habitat)(参考10篇文献)，和其它生境(Other habitat)(包括油田，生物滤池以及虾池等，参考文献6篇)。其中淡水生境包括了湖泊、河流水体及沉积物，湿地生境包括了内陆湿地以及海岸带湿地，农业土壤生境包括施加氮肥的水稻土及其他农业土壤，反应器生境主要指实验室用于研究的小型生物反应器，污水厂生境是指城市污水处理厂中利用生物反应去除城市污水中无机氮的生物反应池。本研究收集的Anammoxers的16S rRNA基因序列涵盖了全球不同地区的不同类型生境，因而能够从宏观上分析不同环境因子主导的厌氧氨氧化细菌的多样性分布规律。

对于从NCBI上收集的部分有质量问题的序列(比如碱基缺失和错位)，在序列分析前需要把这些问题序列去除，以免影响结果分析。另一方面，由于这些基因序列是来自不同学者的个案研究，使用的引物和测序方法都有所不同，导致了不同研究获得的基因序列所覆盖16S rRNA基因的范围都会有所差别。为了能够有效比较序列之间差异性，同时使这些序列能够与我们建立的参考数据库中的序列能够相匹配，需要把这些基因序列统一截取到某一相同位置的片段，把截取后少于100个碱基的序列去除。截取后的序列长度约为455 bp，所有序列片段涵盖了Amx368F/ 820R或者Amx438F/684R引物对扩增的片段之内。因为这2对引物都被广泛应用于厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因分析，因此截取后的基因片段可以用于厌氧氨氧化细菌的生态分布的分析。

1.2 Anammoxers参考数据库的建立

从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载21条具有确切种属鉴定的厌氧氨氧化菌的16S rRNA基因序列，并作为种子序列。同时在GenBank数据库中下载并获得3935条环境样品的厌氧氨氧化菌的16S rRNA基因序列，将获得的全部序列进行整合，利用Mothur软件(https://mothur.org/wiki/MiSeq_SOP)对序列进行处理：(1)以种子序列作为参比序列，进行序列对齐；(2)对环境样品序列进行去冗余，提取非冗余序列；(3)对序列进行长度控制，删除长度小于200个碱基的序列；(4)对剩余序列进行嵌合体检测，去除含有嵌合体片段的序列；(5)利用筛选处理后的序列生成基因序列文件(Template file)，同时，基于序列号在NCBI数据库中搜集各序列对应的种属信息，并利用MEGA 7构建系统进化树，对数据库种属信息进行确认及修正，生成最终的种属信息文件(Taxonomic file)。最后，整合生成的参考文件及种子序列文件信息，生成包含2943条序列的厌氧氨氧化菌16S rRNA基因参考数据库(Anammoxers Reference Database，ARD)。此参考数据库包含16S rRNA基因序列文件和种属信息文件，序列处于368-820之间。。

1.3 利用Mothur软件分析厌氧氨氧化细菌的多样性

1.3.1 不同生境之间的显著性差异分析: 把所收集的基因序列按照八种生境分成8个序列文库。为进一步确认不同生境基因文库之间所产生的差异是真实存在还是因为偶然抽样误差所造成，进一步对8个文库之间的显著性差异进行分析。本研究使用Mothur程序中的Libshuff命令分析这8个序列文库之间的序列组成差异，具体分析流程如下：设显著水平值为0.05，将8个序列文库进行两两比较，共计得到56个比较组，如果两者之间的Libshuff P值Pxy和Pyx都小于0.0008928 (0.05/56)，则表示这2个文库存在显著性差异；如果Pxy值很小而Pyx值很大，则表示Y是X的子集；如果Pxy和Pyx值都大于0.0008928，则表示这2个文库不存在显著性差异。(X和Y代表 2个进行比较的生境序列文库)。

1.3.2 不同生境Anammoxers的α多样性分析: 运用Mothur程序分析不同生境的8个序列文库的多样性指数。绘制序列文库的稀释曲线，得出代表各个生境序列的多样性覆盖程度。通过Mothur程序把不同生境中的序列以80%的阈值(cutoff value)，以建立的Anammoxers参考数据库(RDA)为基准进行种属归类，得出不同生境中Anammoxers在属分类水平上的相对丰度。为了进一步研究Anammoxers主要种属在不同生境中的分布，通过Mothur程序以97%的相似性把序列分型成不同OTU (Operational Taxonomic Unit)，在OTU水平上进行热图分析(Heatmap analysis)，并利用MEGA软件建立进化树，分析Anammoxers的主要种属在不同生境中的分布。

1.3.3 不同生境Anammoxers的β多样性分析: 通过Mothur程序的主坐标分析法(PCoA)分析Anammox细菌在这不同生境之间的分布规律。由于每个生境的序列总数不一样，为了使相异性矩阵是由相同序列的序列库所产生，需要把代表各个生境的序列进行稀释。本次研究在进行PCoA分析前先把每个生境的序列文库稀释成以250条序列数为基准的序列亚文库进行分析，稀释之后共分成46个亚文库，然后利用Mothur的PCoA程序进行序列分析，得到Anammoxers在不同生境之间的分布关系。

2 结果和分析 2.1 厌氧氨氧化细菌在不同类型生境中的多样性指数

通过Mothur的Libshuff P值分析得出8个生境的序列文库之间的显著性差异数值。这8个生境序列文库之间大部分都存在显著性差异(Pxy或Pyx都小于0.0008928)，而部分序列文库之间存在包含与被包含的关系。因为淡水、湿地和“其它”这3个生境的Pyx值较大，表明这3个生境的序列中涵盖的多样性信息可能包含于河口生境序列的信息当中，是河口环境的一个子集。在该显著性差异分析中，没有出现生境序列文库之间无显著性差异的组别，这说明了这8个生境的分组序列文库能够用于多样性的差异分析和比较。

不同生境的Anammoxers的16S rRNA基因多样性指数见表 1。从表 1可知每个生境所收集到的序列数量有显著不同，这表明以往对Anammoxers在生境中多样性的研究的主要区域有偏向性，以往的研究人员主要关注河口和湿地等环境因素复杂的生态系统以及海洋等自然生态系统。从Coverage指数可知，除了“其它”这一组它的覆盖指数比较低以外，剩余7个生境的覆盖指数都接近0.99至1.00，表明收集的序列能够较充分反映该生境中Anammoxers的物种多样性特征。而“其它生境”这组由剩余的171条序列所组成，不能代表某一生境的特性，因此在后续分析当中不考虑分析这一序列组的多样性，主要关注其余7个特征明显的生境类型。

从表 1的多样性指数可以看出，不同生境中的Anammoxers的多样性结构的差别。反应器的Simpson指数比其余生境都要大，表明在反应器中存在某些生态优势度高的Anammoxers种属，多样性较低。同时，这进一步说明了在人为环境因素主导的反应器生境中和在自然生境中的Anammoxers种属演化和分布是有显著的不同。虽然农业土壤生境中包含的基因序列数较多，但其聚类得到的OTU数目却少于淡水生境，其Chao1指数也低，表明农业土壤中Anammoxers物种的多样性较低，某个种属在农业土壤生境中占据绝对优势。另外，湿地生境的Chao1和Shannon指数相对比较高，说明其Anammoxers种属多样性较高；然而，其Evenness指数低于其它生境，表明湿地环境中种属具有较高的均一性，间接反映了湿地生态系统的环境复杂性。淡水和海洋生境的Simpson指数都高于河口和湿地生境，表明受人类活动影响较大的河口和湿地生境中Anammoxers物种多样性要高于淡水和海洋生境，进一步说明了河口和湿地是一个环境复杂的生态系统，具有海洋和陆地混合的显著特征。

图 1给出了不同生境序列文库的稀释曲线。可以看出，不同的生境包含的序列数有较大的差异，以河口和湿地的序列数最多。除了“其他”这个生境类型，其余7个生境的OTU基本都到了平台期，表明这些序列可以反映这些生境中的Anammoxers多样性。

2.2 不同类型生境中厌氧氨氧化细菌的种属组成

图 2是基于序列分类得到的Anammoxers 5个属在不同生境中的分布图。农业土壤生境中以Ca. Brocadia (72.3%)和Ca. Kuenenia (22.8%)为主，同时还有少量的Ca. Anammoxoglobus，但没有发现Ca. Scalindua的存在。而海洋生境中Ca. Scalindua占绝对主导地位，达到98.4%，说明Ca. Scalindua适于在海洋高盐环境中生存。河口生态系统是陆地淡水和与海水的混合区域，其中Ca. Scalindua占了68.7%，其余的是Ca. kuenenia和Ca. Brocadia，没有发现Ca. Anammoxoglobus和Ca. Jettenia。另外，湿地作为与淡水、海洋和土壤都相关的复合的生态系统，其Anammoxers的分布特征与河口生境表现出相似的特征，表明湿地和河口生境具有相似的环境条件。另外，污水厂和反应器这2个工程生态系统中Anammoxers种属具有相似的分布特征，主要为Ca. Brocadia、Ca. Jettenia和Ca. Kunenenia，说明这3个属的Anammoxers可以在反应器和污水厂等受人类活动影响较大的人工构建的生境中生存。但是反应器本省也具有多种不同的类型，不同类型反应器的环境条件对Anammoxers多样性分布的影响还有待于做进一步的研究。Ca. Jettenia普遍存在于反应器、污水厂、和农业土壤等受人为活动影响较大的生境中，但不会出现在高盐度的自然生境中，这说明Ca. Jettenia可能不适合生存在盐度较高的环境中，相关问题需要在未来的研究中做深入探索。

为了进一步分析Anammoxers在不同生境中的分布规律，在OTU水平上进行了更深入分析。图 3和图 4分别是基于所研究的所有生境中丰度较大的前20个OTU所得到的热图(Heatmap)和系统进化树。从图 3和图 4中可以看出，Anammoxers在不同类型生境中的分布规律是不同的。OTU-01在反应器和污水厂中是优势种，在进化树上和Ca. Kuenenia stuttgartiensis相近，而隶属于Ca. Brocadia的OTU物种虽然占比较低但也出现在反应器和污水厂中，但这些Ca. Brocadia应当是工程环境内特有的种属，与自然生态系统中普遍存在的Ca. Brocadia有所不同。OTU-05在河口生境中的丰度最高，其次是OTU-03也有较高的丰度。根据进化树的分析，OTU-05和OTU-05分别归属于Ca. Scalindua和Ca. Kuenenia。在海洋环境中OTU-08的丰度最高，进化树分析它归属于Ca. Scalindua属。虽然海洋和河口生境中都普遍存在Ca. Scalindua，但海洋的优势种OTU-08与河口的优势种OTU-05在进化树上属于Ca. Scalindua的不同分支内，表明河口和海洋中存在不同Ca. Scalindua种，这种群落结构的差异可能是由于河口和海洋环境的差异而导致的。在淡水生境中，OTU-06丰度最高，进化树上归属于Ca. Brocadia属，而且也发现有少量Ca. Scalindua OTU的存在，但与海洋和可口中的Ca. Scalindua的out有所不同，表明在淡水生境中存在于自身环境相适应的独特的物种。湿地环境的Anammoxers的种属分布相对均匀，前20个高丰度的OTU在湿地生境中都含有一定的丰度，说明了湿地环境是Anammoxers多样性较高的环境。在农业土壤中，OTU-14和OTU-10的相对丰度较高，它们归属于Ca. Brocadia属。另外，属于Ca. Kuenenia OTU-01在农业土壤中也占有一定的丰度。而在其中存在的OTU18，在进化上无法归入目前被鉴定的Anammoxers的5个属，推测它可能是代表了1个未知的物种，这种物种可能是受农业土壤受肥料的高氨氮物质的影响。

2.3 不同类型生境中厌氧氨氧化细菌的种属分布差异

为了更好的阐明Anammoxers在不同典型生境之间的分布规律，本次研究以Anammoxers的16S rRNA基因序列经过Mothur程序分析得到PCoA坐标图(图 5)。从图 5可以看出，河口、海洋和农业土壤生境的样品各自都有显著的分布距离，表明在这3种生境中Anammoxers呈现出不同的群落结构组成。淡水生境的样品和反应器以及农业土壤样品距离相近，说明Anammoxers在淡水和反应器环境中的分布规律与在农业土壤中相近。但其中有1个淡水样品点有明显分离，说明Anammoxers在部分淡水环境中也有其相对不同的群落结构组成。海洋生境中的样品点几乎都聚类在一起，说明了Anammoxers在海洋环境中的组成相对一致。然而，Anammoxers在河口环境中也表现出明显不同的特征，有的样品点与淡水的样品接近，而有些样品点与海洋的样品接近，进一步表明了河口生境中的Anammoxers的结构具有淡水与海水生境混合的特征。湿地生境的样品点表现出分散的分布特点，与海洋、土壤、淡水和河口的样品都有接近，表明湿地环境中的Anammoxers的多样性组成特征，同时也反映了了湿地生境是一个相对复杂的生态环境系统。

2.4 不同生境的环境因素与厌氧氨氧化菌种群结构的关系

上述结果表明，Anammoxers在不同类型生境中的多样性分布具有明显的差异。这种差异应当是适应不同生境中的不同的环境因素长期进化的结果，演化出适应特定环境的优势种属，导致不同类型的生境中Anammoxers种群结构的不同。海洋环境当中主要存在Ca. Scalindua，说明Ca. Scalindua适于在高盐度的环境下生存。已有研究表明，在实验室反应器的高盐浓度条件下的富集培养过程中，Anammoxers群落结构逐渐从Ca. Kuenenia为优势演化为以Ca. Scalindua占优势^[23]，进一步说明了盐分影响了Anammoxers的群落结构的演替。虽然Anammoxers丰度随盐度的上升而增加^[24]，但是Anammoxers的活性却与盐度成负相关^[25]。因此还需要更多的研究把盐度和其它环境因素进行综合分析，才能更精确的理解Anammoxers受盐度的影响效应，例如海水深度和温度^[26]。另一方面，为了研究Ca. Scalindua能够适应海洋环境的机制，已有研究通过宏基因组的对比分析得出Ca. Scalindua能够表达一种对NH₄⁺和NO₂^–高亲和力的蛋白质，使其能够适应缺少NH₄⁺和NO₂^–的海洋环境。此外，还有研究表明Ca. Scalindua能够矿化海洋环境中的有机酸作为NH₄⁺的来源^[27]。

淡水环境中Ca. Brocadia属的厌氧氨氧化菌占据优势地位^[28-29]。然而在地下水的研究中，却发现Ca. Kuenenia、Ca. Jettenia和Ca. Scalindua属的Anammoxers^[30]，这可能是由于地下水的环境与一般淡水环境有显著的不同，但有关在地下水环境的Anammoxers的多样性分布及代谢功能的研究还非常少。

在农业土壤生境中，除了Ca. Scalindua，其它的4个种属都有存在，其中Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia丰度最高。土壤的深度、营养盐浓度、氧气含量和pH都会影响Anammoxers在土壤中的多样性分布^[31-32]。

反应器和污水厂这2个工程生态系统中主要存在Ca.Brocadia和Ca.Kuenenia，其中Ca. Brocadia占据优势。但工程系统中的大部分的Ca. Brocadia在系统进化上与其他生境的Ca. Brocadia有显著的不同。先前的研究表明，Ca. Brocadia sinca在工程系统中比Ca. Kunenenia stuttgartienis有更强的适应性，因为Ca. Brocadia sinca对NH₄⁺和NO₂^–有着更强的亲和性，对氧气有更高的耐受力，其生长速度也较快^[33]。也有研究表明，在不稳定的浓度波动的NO₂^–环境下进行富集培养，以Ca. Brocadia为主的菌群逐渐演化成以Ca. Kuenenia为主^[34]。此外，在海洋环境中以Ca. Scalindua为主的样品经过生物反应器的培养后，会演化变成以Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia为主。这都进一步说明了反应器和污水厂的特殊环境适于Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia的生存。

河口和湿地环境当中普遍存在Ca. Brocadia、Ca. Scalindua和Ca. Kuenenia，是多样性最高的2个自然生态系统，其中河口中的Ca. Scalindua和海洋中的Ca. Scalindua在进化树上的处于不同的分支，表明河口有其特殊的Anammoxers的演化机制。这可能是因为河口和湿地作为复杂的生态系统，收到海洋潮汐、径流输入和人类活动的综合作用，这些因素都可能会影响Anammoxers的群落结构和多样性分布。

3 结论

本研究基于NCBI数据库中Anammoxers的16SrRNA基因序列，利用Mothur程序进行了不同类型生境中Anammoxers多样性分析。研究结果表明，海洋环境中Ca. Scalindua属占有绝对主导优势，淡水环境中存在Ca. Scalindua、Ca. Kuenenia和Ca. Brocadia，其中Ca. Brocadia占据优势地位。反应器和污水厂这2个工程系统中主要存在Ca. Brocadia、Ca. Kuenenia和少部分的Ca. Jettenia。农业土壤中主要存在Ca. Brocadia、Ca. Kuenenia和少部分Ca. Anammoxoglobus与Ca. Jettenia，不存在Ca. Scalindua。其中农业土壤中占优势的Ca. Brocadia在进化树上的位置与其它自然生态环境的有显著不同，但是与工程系统中的类型相似，推测农业土壤环境与工程系统具有的高氨氮浓度是影响Ca. Brocadia多样性分布的重要因素。河口和湿地Anammox细菌的多样性最高，普遍存在Ca. Scalindua、Ca.Brocadia和Ca. Kuenenia，与河口湿地的陆海相互作用的环境特征相一致。总之，Anammoxers在不同生境中有不同的群落结构和生态分布，是适应不同的生境中的特殊化境长期演化的结果。