2019, Vol. 59中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 李平花, 马雪青, 袁红, 袁子文, 孙普, 白兴文, 卢曾军, 刘在新. 2019
- Pinghua Li, Xueqing Ma, Hong Yuan, Ziwen Yuan, Pu Sun, Xingwen Bai, Zengjun Lu, Zaixin Liu. 2019
- 3A蛋白104-115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建
- Construction of type A foot-and-mouth disease marker virus with deletion of 104-115 amino acids of 3A protein
- 微生物学报, 59(5): 907-915
- Acta Microbiologica Sinica, 59(5): 907-915
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文章历史
- 收稿日期：2018-08-08
- 修回日期：2018-11-15
- 网络出版日期：2018-11-19
引用本文 |
2. 甘肃农业大学动物医学院, 甘肃 兰州 730070
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种烈性传染病。世界动物卫生组织将其列为必报疫病之首，我国规定为一类动物传染病。该病的爆发和流行，往往对一个国家的畜牧业生产、肉品供应、畜产品、国际贸易及外交政治关系造成重大负面影响，因此世界各国十分重视对该病的研究和防制。
FMD的病原为口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。病毒存在7个血清型(A、O、C、AsiaI、SAT I、SATⅡ和SAT III)[1]和许多的亚型[2]，型间不交叉保护。
我国是口蹄疫流行较为严重的国家，特别是近年来A型FMD在我国广东、青海、新疆、西藏、云南、江苏、安徽、湖北等省份大范围暴发，给我国养殖业造成巨大的经济损失。灭活疫苗的强制免疫是预防和控制FMD的关键措施，但是目前广泛使用的FMDV灭活疫苗因抗原纯化不完全，多次免疫动物后仍能在体内产生相应的非结构蛋白抗体[3-4]，这严重影响了以检测FMDV非结构蛋白抗体为金标准的鉴别诊断结果，从而干扰了疫病的血清学监控和流行病学调查。因此亟待开发一种既能有效免疫预防，又能精准区分自然感染和疫苗免疫动物的FMD A型鉴别诊断疫苗，为口蹄疫的有效预防、控制乃至消灭提供新的技术支撑。
鉴于此，本研究以近年来我国流行的A型FMDV A/Sea-97/CHA/2014株全长感染性克隆为骨架，通过融合PCR技术构建含FMDV 3A非结构蛋白免疫优势表位(AEKNPLE)缺失的全长克隆，体内转染拯救重组病毒，研究其生物学特性和发展标记疫苗的潜力，从而为未来FMD A型标记疫苗的发展提供前期材料。
1 材料和方法 1.1 质粒和细胞FMDV A/Sea-97/CHA/2014株全长感染性克隆pQAHN [5]和含该病毒基因5340–8200 nt的质粒pSK-A4[5]以及该全长质粒拯救的亲本病毒r-A/Sea-97/CHA/2014 (本文中命名为r-A/Sea97)为兰州兽医研究所宿主抗感染与免疫生物学团队构建保存。表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7稳定细胞系由德国Karl-Klaus Conzelmann教授惠赠。
1.2 主要试剂和动物JM109感受态细胞、DNA片段回收试剂盒、DNA Gel Extraction Kit、T4连接酶、反转录酶AMV、内切酶、LA Taq扩增酶、质粒提取试剂盒、DNA marker购自大连TaKaRa公司，胰酶、胎牛血清(FBS)、细胞基础培养基购自Gibco公司；RNeasy mini Kit试剂盒购自Qiagen公司；FITC-山羊抗小鼠lgG购自BOSTER公司；FMDV特异的抗3A单抗3A24和抗3 B的单抗3 B4 B1由本课题组制备保存；60日龄健康易感的猪购自定西散养农户。
1.3 引物根据已构建的A/Sea-97/CHA/2014株全长序列，设计PCR引物(表 1)，由上海桑尼生物技术有限公司合成。
| Names | Sequences (5′→3′) |
| A/HN10 4-11 5(+) | CAAACATCACCACAGATGACACTACCGGTGCCAGCACCGT |
| A/HN10 4-11 5(–) | ACGGTGCTGGCACCGGTAGTGTCATCTGTGGTGATGTTTG |
| A/HN532 1(+) | GTTCAGGAGGTGATTGATCG |
| A/HN676 7(–) | AACACGCCGTGTGCCACGGT |
1.4 3A蛋白104–115位氨基酸缺失FMDV全长cDNA克隆的构建
研究表明FMDV 3A蛋白的109–115位氨基酸(AEKNPLE)为免疫优势的B细胞表位，故本研究选取包含该区段的氨基酸104–115作为缺失的靶点。以已构建保存的pSK-A4为模板，分别用A/HN5321(+)/A/HN104-115(–)和A/HN104-115(+)/ A/HN6767(–)引物分别扩增得到C片段和D片段。纯化回收的C和D片段等量混合作为模板，以OZ5321(+)/OZ6767(–)为引物扩增CD片段。CD片段用Hind III/Bgl II酶消化后回收约1450 bp的片段，pSK-A4质粒用Not I/Hind III酶消化后回收约1500 bp的片段，pSK-A1234用Not I/Bgl II消化后回收约8400 bp的片段。然后三片段连接、转化、提质粒，电泳和酶切鉴定得到重组质粒pQAHN/3A104-115。将酶切鉴定正确的重组质粒送西安擎科生物有限公司进行序列测定，验证构建重组质粒的正确性。3A蛋白104–115位氨基酸缺失FMDV基因组示意图见图 1。
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| 图 1 蛋白104–115位氨基酸缺失FMDV基因组示意图 Figure 1 Schematic diagram of the genome of FMDV with deletion of 104–115 amino acids in 3A protein |
1.5 病毒的拯救
用QIAGEN Plasmid Midi Kits制备质粒pQAHN/3A104-115，Not I线化后用LipofectamineTM 2000介导转染生长至70%–90%满的BSR/T7细胞。转染后5 h加入1 mL GMEM完全培养基，置CO2培养箱37 ℃继续培养，72 h后收获病毒，反复冻融3次后在BHK-21上连续传代，冻存备用。拯救的基因工程病毒命名为r-A/Sea97/3A104-115。
1.6 标记病毒的鉴定 1.6.1 RT-PCR和序列的测定: 取转染的细胞上清350 μL，用RNAasy Mini Kit提取细胞总RNA。然后用OZ5321(+)/OZ6767(–)引物对一步法扩增含3A基因的特定片段，纯化回收后送西安擎科生物有限公司进行序列测定。 1.6.2 间接免疫荧光: BHK-21单层细胞(6孔培养板)生长至70%满时分别接种转染的上清和亲本病毒。8 h后吸弃培养液，用PBS漂洗3次，吸完残液，3.7%多聚甲醛室温固定30 min；PBS洗涤3次，加0.5% Triton X-100室温作用10 min；PBS洗涤3次，滴加FMDV 3A单抗3A24或3 B单抗3 B4 B1，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，加FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，用甘油封片于Olympus荧光显微镜下观察并拍照。 1.6.3 Western blotting分析结果: BHK-21单层细胞生长至90%满时接种亲本病毒和转染上清，感染10 h后弃培养液，用PBS (0.01 mol/L，pH值7.2)漂洗2次后收集细胞，用PBS重悬，反复冻融裂解，离心后上清进行SDS-PAGE。分离的蛋白分别转印到NC膜，然后用FMDV特异的单抗3A24和3 B4 B1进行免疫印记，最后用显影液显影拍照。 1.6.4 拯救病毒的遗传稳定性分析: 将r-A/Sea97/ 3A104-115病毒按10%接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察病毒感染细胞出现典型致细胞病变的时间。收集第5、15、20代病毒提取总RNA后进行RT-PCR和序列测定，分析拯救病毒3A蛋白氨基酸的变化。 1.7 标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线将第6代标记病毒和亲本病毒分别作10倍系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200 μL/孔，6孔板)，置于CO2培养箱，每10 min摇动1次。1 h后加入2 mL黄芪胶混合液(1份2× MEM，1份1.2%黄芪胶，1%血清)静止培养。48 h后吸弃培养液，用PBS洗涤2次后加入固定液(50%丙酮+50%甲醇)室温固定30 min。之后结晶紫染色1 h，清水冲洗，观察病毒的噬斑表型，并计算每个病毒的噬斑形成单位(PFU)。将第6代标记病毒和亲本病毒以5个MOI (Multiplicity of infection，MOI)的病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25 mL培养瓶)，吸附1 h后弃病毒液，用MEM洗2次后，加5 mL MEM培养基并置于37 ℃ CO2培养箱继续培养。接种后4、8、12、20 h分别收取样品，反复冻融3次后在BHK-21单层细胞上(96孔板)按照常规方法测定病毒的滴度(TCID50)(实验重复2次)，绘制病毒的一步生长曲线。
1.8 动物实验选取60日龄健康易感的猪10头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1:6，3ABC抗体阴性)，分为3组。第一组4头，肌肉注射2 mL第8代r-A/Sea97/3A104-115病毒液(含107 TCID50)，第二组4头，肌肉注射2 mL第8代r-A/Sea97病毒液(含107 TCID50)，第三组2头，注射2 mL PBS作为对照。接种后连续10 d观察所有试验动物出现口蹄疫临床症状的情况。收集水泡皮组织研磨后提取细胞总RNA，RT-PCR和序列分析，确认动物出现的临床症状是由接种的病毒所引发。动物接种28 d后采血，分离血清，检测动物产生的结构蛋白抗体、非结构蛋白抗体和针对3A单抗的表位抗体。所有抗体的检测按照试剂盒操作说明进行。
2 结果和分析 2.1 3A蛋白104–115位氨基酸缺失FMDV全长cDNA克隆的构建用特定引物分别扩增出与预期大小相符的C、D和CD目的片段(图 2)。CD片段和pSK-A4质粒用特定内切酶线化后回收目标片段，并连入特定酶消化的pSK-A1234中，得到阳性质粒pQAHN/3A104-115。该质粒用Bgl II和Not II酶切鉴定，结果切出与预期大小相符的目的条带(图 3)。酶切鉴定正确的全长质粒进行测序验证，结果表明我们成功构建了含3A蛋白104–115位氨基酸缺失的FMDV全长cDNA克隆。
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| 图 2 融合PCR结果 Figure 2 The results of fusion PCR. Line 1: C frangment; Line 2: CD frangment; Line 3: D frangment; Line 4: DNA marker |
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| 图 3 质粒的酶切鉴定 Figure 3 Identification of plasmid with restriction enzyme digestion. Lane 1: The plasmids pQAHN/3A104-115 digested with Bgl Ⅱ and NotⅠ; M: DNA marker |
2.2 病毒的拯救
pQAHN/3A104-115质粒转染BSR/T7细胞48 h后，部分正常细胞变圆，变大，为FMDV感染BHK-21细胞后明显的致细胞病变效应，对照细胞生长良好(图 4)。拯救的重组病毒命名为r-A/Sea97/ 3A104-115。
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| 图 4 质粒转染BSR/T7细胞后引起的致细胞病变 Figure 4 The cytopathic effect induced by the plasmid transfection of BSR/T7 cell. A: Normal BSR/T7 cell; B: BSR/T7 cell after transfection of the plasmid |
2.3 拯救病毒的鉴定 2.3.1 RT-PCR: 对转染的上清用特定引物进行RT-PCR和序列测定，结果表明成功构建了含3A 104–115位氨基酸缺失的重组FMDV。 2.3.2 间接免疫荧光分析: 转染的上清和亲本病毒接种BHK-21细胞8 h后分别对其进行间接免疫荧光检测，结果显示接种转染上清的BHK-21细胞用3A单抗作用看不到可见的绿色荧光，而用3 B单抗作用能看到明显的可见荧光，而亲本病毒感染的细胞用3A和3 B单抗作用均可看到可见的绿色荧光(图 5)，表明本研究拯救的标记病毒为正确的构建。
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| 图 5 标记病毒的间接免疫荧光鉴定 Figure 5 Identification of the marker FMDVs by IFA |
2.3.3 Western blotting分析: 标记病毒免疫印迹分析结果表明转染上清感染的BHK-21细胞能与3 B单抗反应，不与3A单抗反应，而亲本病毒感染的BHK-21细胞均能与3A和3 B单抗反应。说明拯救的病毒为正确的构建，3A蛋白104–115位氨基酸的缺失取消了重组FMDV与3A单抗的反应能力，适合作标记疫苗候选毒株，结果见图 6。
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| 图 6 Western blotting分析重组病毒和亲本病毒 Figure 6 Western blotting analyze the recombinant virus and parental virus |
2.3.4 拯救病毒遗传稳定性分析: 将拯救的重组病毒在BHK-21上连续传代，细胞病变时间逐渐缩短，病变更加典型，传至第5代，病变时间逐渐稳定，95%以上细胞病变时间为10–12 h。对第5、15和20代细胞毒RT-PCR和测序分析，结果表明引入的缺失稳定存在，适合作病毒的遗传标记。 2.4 标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线
亲本病毒和标记病毒的噬斑实验结果表明，标记病毒和亲本病毒均可在BHK-21细胞上形成噬斑，且噬斑形态相似。病毒的一步生长曲线也表明重组病毒和亲本病毒具有相似的生长特性，3A蛋白氨基酸的缺失没有明显影响标记病毒的复制能力(图 7)。
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| 图 7 FMDV的噬斑形态和一步生长曲线 Figure 7 The plaque phenotype and one-step growth curves of the recombinant viruses. A: the plaque phenotype of FMDV; B: one-step growth curves of FMDVs |
2.5 动物实验和抗体检测
标记病毒和亲本病毒接种猪2 d后，所有接种病毒的动物均表现体温升高，食欲减退，精神萎靡。到接种第5天，所有动物均在2蹄部和/或舌面出现水泡性症状，而对照动物在整个实验过程中未出现发烧和水泡性症状。收集发病动物的水泡并对其进行RT-PCR和序列的测定，结果表明动物水泡皮内均含与预期接种病毒一样的序列，说明动物出现水泡性症状是由接种的FMDV引起的，而且标记病毒和亲本病毒均对猪有很强的致病性。另外标记病毒和亲本病毒感染28 d的猪后均产生了结构蛋白抗体(LPBE)和非结构蛋白抗体(3ABC)，表明接种的病毒在动物体内进行了有效的复制。但只有接种亲本病毒的动物均产生了针对3A表位的抗体，而接种标记病毒的动物均未产生针对3A表位的抗体，说明可以通过缺失FMDV 3A蛋白104–115位氨基酸来发展FMD A型标记疫苗，用于我国口蹄疫的有效防控(表 2)。
| Virus | Pig number | LPBE antibody | 3ABC antibody | 3A epitope antibody | |||||
| 28 d | 0 d | 28 d | 0 d | 28 d | 0 d | ||||
| r-A/Sea97 | 1304 | 1:720 | < 1:6 | + | – | + | – | ||
| 1340 | 1:512 | < 1:6 | + | – | + | – | |||
| 1366 | 1:256 | < 1:6 | + | – | + | – | |||
| 1370 | 1:256 | < 1:6 | + | – | + | – | |||
| r-A/Sea97/ 3A104-115 | 1306 | 1:360 | < 1:6 | + | – | – | – | ||
| 1319 | 1:256 | < 1:6 | + | – | – | – | |||
| 1351 | 1:512 | < 1:6 | + | – | – | – | |||
| 1388 | 1:128 | < 1:6 | + | – | – | – | |||
| Control (PBS) | 1352 | < 1:6 | < 1:6 | – | – | – | – | ||
| 1367 | < 1:6 | < 1:6 | – | – | – | – | |||
| –: Negative; +: Positive. | |||||||||
3 讨论
标记疫苗(Marker vaccine)也称DIVA (Differentiating infected from vaccinated animals)疫苗，它免疫动物后产生的抗体能通过与之相配套的血清学检测方法与自然感染的动物相区分，是近年来动物疫病研究的热点，尤其是随着RNA病毒反向遗传操作技术的不断发展，各类重大动物疫病基因缺失标记灭活疫苗的开发。到目前为止，研究者利用反向遗传操作技术已经成功发展了猪瘟病毒[6]、新城疫病毒[7]、呼吸与繁殖障碍综合征[8]和马动脉炎病毒[9]等的基因缺失标记疫苗。利用该技术发展FMDV基因缺失标记疫苗始于2010年，Fowler等通过删除FMDV结构蛋白G-H环发展了标记病毒灭活疫苗。研究也表明该标记疫苗既能完全保护牛对强病毒的攻击，又能够区分自然感染和疫苗免疫的动物[10]。但是FMDV的结构蛋白(包括G-H环)是病毒诱导机体产生中和抗体的关键基因，因此，后期标记疫苗的开发主要是通过缺失病毒非结构蛋白免疫优势的表位而设计[11]。如2012年，Uddowla等通过缺失FMDV 3 B或3 D蛋白优势表位发展了致弱的标记疫苗[12]，它们免疫动物后能够用配套的诊断方法与自然感染的动物相区分。但弱毒疫苗容易发生毒力返祖，目前FMD疫苗市场已经不再使用。2014年，本实验室通过缺失O型FMDV 3A蛋白93–143位氨基酸(包含免疫优势的AEKNPLE表位)在国内首次开发了能够区分感染和疫苗免疫动物的O型FMD标记疫苗[13]，其中3A蛋白93–143位氨基酸的缺失未显著影响标记病毒的复制。2015年和2018年，研究者通过同时缺失不同长度的3AB，研究其开发FMD标记疫苗的潜力[14-15]，但多表位或者大片段基因的缺失会严重影响病毒的复制，不适合疫苗的生产。
针对前期标记疫苗研究的成功经验和我国近年来A型口蹄疫的流行形势以及市场的需求，本研究利用当前流行的A型FMDV的反向遗传技术平台，成功构建了含3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒。拯救的病毒与亲本病毒具有相似的生长特性和复制能力，在BHK-21细胞上连续传代，非结构蛋白的缺失稳定存在。用3A单抗(识别AEKNPLE表位)开发的阻断ELISA方法能够明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。
本研究成功构建的标记病毒可以用于开发FMD A型标记疫苗，用于我国口蹄疫的有效防控。
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