与花生建立共生关系的根瘤菌以慢生型根瘤菌为主，它们以相对古老的“裂隙侵染(crack entry)”方式进入宿主。研究发现，以“侵染线”方式入侵的根瘤菌中，Ⅲ型分泌系统(T3SS)参与根瘤菌-豆科植物相互作用，在一定程度上影响根瘤菌的共生专一性，并且Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI受植物类黄酮物质的诱导，进而转录调节因子TtsI会调节Ⅲ型分泌系统相关基因的表达，在菌植互作中起着有益、有害或中性作用^[1-3]。菌株USDA122的T3SS调控基因ttsI突变后接种到大豆品种Hardee，与野生型菌株相比，突变菌株获得了结瘤能力^[4]。B. elkanii SEMIA587中转录调节基因ttsI突变后，分别接种3个不同的大豆品种Embrapa 48、Peking和McCall，与野生型相比，在前两种大豆品种上，△ttsI突变体的结瘤数明显下降；但在后者中，△ttsI突变体对结瘤几乎没有影响^[5]。当M. loti的T3SS转录调节基因ttsI缺失后，表现为在Lotus corniculatus subsp. frondosus中结瘤数减少，然而在Lotus halophilus中结瘤数却明显增加^[6]。相比之下，目前对Ⅲ型分泌系统以“裂隙侵染”的花生-根瘤菌互作中的功能研究相对滞后。

大豆根部主要分泌大豆苷元和染料木黄酮来吸引根瘤菌，并且近期研究发现大豆在营养生长的不同阶段，根部分泌的大豆苷元和染料木黄酮等黄酮类化合物的种类和含量会发生变化，尤其是在氮饥饿条件下，大豆根际分泌物中的大豆苷元和染料木黄酮分别增加了8倍和15倍^[7]。此外，有研究者发现不同花生品种在幼苗期黄酮类化合物的含量存在差异，以大豆苷元为主而几乎检测不到染料木黄酮化合物的存在^[8]。因此，本研究选取了这两种黄酮类化合物考察其对慢生型花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统的影响。本实验室前期研究发现一群新的结瘤遗传型^[9]，其代表菌株为MZ5。为进一步明确MZ5的Ⅲ型分泌系统在菌植互作中的功能，本研究首先构建了该菌株的Ⅲ型分泌系统的调节基因ttsI的突变体，在转录水平上探究了不同黄酮类物质对该菌株野生型及其ttsI突变体的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI表达的影响，并通过蛭石结瘤实验比较分析野生型和突变体在花生结瘤能力的差异，进一步探究Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作中的作用。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株:

供试的慢生型花生根瘤菌菌株Bradyrhizobium sp. MZ5(缩写MZ5)是分离自广东省梅州土壤的花生根瘤，由本实验保存，具体信息参见文献[9]。

1.1.2 试剂:

实验用大豆苷元和染料木黄酮均购买于Sigma-Aldrich公司上海分公司；荧光定量PCR及反转录试剂购于TaKaRa公司；细菌总RNA提取试剂盒购于北京博陵科公司。定量用引物由上海英潍捷基公司合成。实验用质粒pRK2013为中国农业大学陈文新课题组馈赠；pK18mobsacB购于武汉淼灵生物。

1.1.3 培养基:

活化及培养MZ5及突变株采用TY^[10]或YMA培养基^[11]，28 ℃培养。黄酮类物质诱导的培养基为AG培养基^[12]。SM培养基用于三亲本杂交筛选^[13]。活化及培养E. coli菌株采用LB培养基^[14]，37 ℃培养。

1.2 △ttsI突变体质粒载体的构建

提取慢生型花生根瘤菌总DNA，根据ttsI基因的核酸序列设计上下游引物ttsI36F和ttsI341R，分别添加BamH I和Hind Ⅲ酶切位点(表 1)。扩增ttsI基因的部分片段，与载体pMD-19^T连接，双酶切重组质粒和pK18mobsacB自杀载体，连接、转化，获得ttsI基因体外突变的重组质粒pK18mobsacB-△ttsI。DNA提取参照文献[15]的方法；质粒的提取、DNA的限制性酶切和连接等操作参照文献[16]的方法进行。

1.3 花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体的构建

三亲本接合转移的方法构建ttsI突变体。具体操作方法按文献[17]操作。

1.4 黄酮类物质对花生根瘤菌菌株的体外诱导

将MZ5及其突变体培养在含有相应抗生素的AG培养液中至稳定期，5%接种量接种于新鲜的AG培养液中，分别添加大豆苷元和染料木黄酮至终浓度为1 μmol/L，180 r/min恒温(28℃)振荡培养72 h。以只添加等体积DMSO的AG培养基的培养物为阴性对照，每个处理分别接种3个重复。5000 r/min离心收集菌体，洗涤后保存于–80 ℃冰箱用于总RNA提取。

1.5 花生根瘤菌总RNA的提取及反转录

细菌总RNA提取方法按照北京博陵科为公司HiFi-Ex细菌RNA快速提取试剂盒的操作手册进行。提取后的总RNA经DNase I消化并抽提，以去除基因组DNA污染。纯化后细菌总RNA用随机引物按照TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒进行反转录。

1.6 花生根瘤菌的荧光定量PCR

根据供试菌株Ⅲ型分泌系统中的ttsI基因设计定量引物，以recA基因作为内参基因，本研究所用引物见表 1。Real time qPCR程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 20 s；72 ℃ 20 s，循环40次；72 ℃ 5 min。信号检测染料使用SYBR GREEN，相对表达量采用2^–ΔΔCT的方法分析。

1.7 蛭石结瘤实验

分别收集培养至对数生长期的MZ5菌体及其突变体的菌体用灭菌的生理盐水制成40 mg/mL的菌悬液。将花生汕油523 (缩写为S523)和粤油45 (缩写为Y45)的种子表面消毒并播种^[18]。以不接菌的植物作为空白对照，实验组的植物接种1 mL菌液，每个处理4–6个重复。置于26–28 ℃培养，光照和黑暗时间分别为16 h和8 h。培养40 d后收获并统计总瘤数、有效瘤数、地上部干重，同时固定根瘤进行石蜡切片分析^[9]。

2 结果和分析 2.1 △ttsI突变体的验证

将通过三亲本接合转移获得的能够在双抗平板上生长的结合子，用引物M13R/ttsI341R和pK18T/ttsI341R进行PCR验证，分别可以扩增出326 bp和506 bp的片段，证明结合子确实发生ttsI基因的插入突变(图 1)。为进一步明确△ttsI突变株的ttsI基因成功发生了插入突变，利用pK18-T/△ttsI745R引物对进行PCR扩增并将相应的PCR纯化产物送至北京六合华大基因公司进行测序。

2.2 不同黄酮类物质对ttsI基因的表达影响

在图 2中，添加大豆苷元对MZ5的ttsI基因表达量的影响，与未添加大豆苷元对照相比，表达量降低并且差异显著(P < 0.05)；染料木黄酮处理后与对照相比，MZ5的ttsI基因表达的抑制作用达到极显著差异水平(P < 0.001)。在添加或不添加两种黄酮类物质的条件下，突变体MZ5△ttsI的ttsI基因的表达量都明显下调，表达量仅为野生型的10%–30%，且差异都达到了极显著水平(P < 0.001)。这表明MZ5 △ttsI突变体中的ttsI基因由于插入突变，使得其ttsI基因的表达量都明显下调，与野生型菌株相比都达到了极显著水平(P < 0.001)。且大豆苷元和染料木黄酮对ttsI基因的诱导作用丧失。

2.3 ttsI基因对花生结瘤特征的影响

由图 3-A可知，MZ5 ΔttsI突变体仍具有在花生粤油45和汕油523的结瘤能力。但是与野生型MZ5相比，突变体的总瘤数和有效瘤都明显减少，且均达到极显著水平(P < 0.001)。其中，野生型MZ5的有效瘤数均占89%，而接种MZ5 ΔttsI突变体的有效瘤数仅为65%和62%。MZ5 ΔttsI突变体接种2个花生品种的地上部干重(图 3-B)，与野生型MZ5相比也显著降低(P < 0.05)，表明该突变体对花生的生长产生负面的影响。

野生型MZ5及MZ5 ΔttsI突变体根瘤石蜡切片结果见图 4。在野生型MZ5侵染花生的根瘤中，从外侧到内侧分别分化出根瘤皮层区、根瘤维管束区域和在根瘤最内侧染色加深的部位即明显的含菌细胞区域，根瘤菌基本占领了内部的中央细胞区域(图 4-A、B和图 4-E、F)。在MZ5△ttsI突变体的根瘤切片中，其内部基本结构上发现根瘤皮层区、根瘤维管束区域所占区域比较大，而根瘤菌所占领内部的中央细胞区域比较小，含菌数量减少，即在中央区域存在较多未着色的空白区域(图 4-C、D和图 4-G、H)。

3 讨论

李俊等发现有些花生根瘤菌与大豆存在共生结瘤作用，并且有些大豆根瘤菌也能和花生存在共生结瘤作用^[19]。本研究前期实验发现MZ5能够与多个不同花生品种和野大豆结瘤，但与多个大豆品种以及豇豆不结瘤。基于前期对MZ5与其他22株具有T3SS的慢生型花生根瘤菌的T3SS结构基因rhcJ-C1、固氮基因nifH和共生相关基因nodD-A的系统发育分析的基础上，发现其共生基因的遗传背景与近年来研究较多的Bradyrhizobium japonicum和Bradyrhizobium diazoefficiens相差较远，可能代表一个新的结瘤遗传型^[9]。已发现快生型根瘤菌中的Ⅲ型分泌系统赋予根瘤菌宿主特异性，能够影响根瘤菌的宿主范围^[20-22]。在Sinorhizobium sp. NGR234的基因组中存在大量的分泌系统相关基因，这可能是导致其具有广宿主的原因^[23]。最近，在以“裂隙”方式侵染的“合萌-慢生型根瘤菌”互作系统中，B. elkanii USDA61菌株中Ⅲ型分泌系统的ttsI及rhcJ基因分别突变后，均丧失了与“不依赖于结瘤因子”的豆科植物宿主印度合萌Aeschynomene indica的结瘤作用^[24]。同时发现光合慢生根瘤菌ORS285虽然缺少T3SS，但是仍可以与宿主印度合萌Aeschynomene indica结瘤。由此可见，在不同的豆科宿主和根瘤菌互作中，Ⅲ型分泌系统的功能是多样的。在MZ5中添加大豆苷元和染料木黄酮对Ⅲ型分泌系统的调节基因ttsI的表达均有下调作用。

本研究成功构建了MZ5ΔttsI突变体，通过蛭石结瘤实验比较了野生型和突变体在原宿主的结瘤能力差异。当MZ5的调节基因ttsI发生插入突变后，降低了其在汕油523和粤油45的结瘤能力，说明MZ5的T3SS在与花生建立共生关系时发挥着重要作用。目前本研究只证实了ttsI基因突变会影响菌株在花生上的结瘤能力，此基因突变后是否会改变宿主范围，还需要接种更多不同豆科宿主植物进行更深入的研究。MZ5的T3SS中ttsI基因突变后会影响其哪些效应因子，这些效应因子在根瘤菌与花生建立共生关系过程中的作用也需要进一步研究。