在低GC含量的革兰氏阳性细菌中，含有一种分解代谢物控制蛋白A (catabolite control protein A，CcpA)，属于LacI-GalR家族的转录因子^[1]。CcpA作为一个多效调控因子，通过与启动子上的保守cre (catabolite repression element)序列结合^[2]，在细菌中调控许多重要的生理功能，如在变异链球菌(Streptococcus mutans)中，Cid/Lrg操纵子系统与细胞自溶、生物膜形成、葡萄糖基转移酶表达和氧化应激反应相关，CcpA通过与cid和lrg启动子的结合从而调控该菌株的这些生理功能^[3-4]；枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis，Bs)中，GntR调控gntRKPZ操纵子，CcpA通过分别与gnt的启动子和gntR的启动子结合从而调控葡萄糖酸盐的代谢过程^[5]。

Sigma因子是RNA聚合酶核心酶的亚基，在细菌的转录起始调控过程中具有重要的作用。Sigma因子按照功能可分为Sigma70和Sigma54两种，区别在于Sigma70识别启动子的–10和–35区，而Sigma54识别启动子的–12和–24区，并需要与特定的增强子结合蛋白(enhancer binding proteins，简称EBPs)共同作用，才能激活起始转录^[6]。EBPs具有3个典型的结构域：N端的信号结构域(R domain)，负责感应外界信号；中间的AAA⁺结构域(C domain)，负责与Sigma54因子相互作用；C端的HTH结构域(D domain)，通过与启动子上特定序列结合，从而起到调控作用^[6]。许多细菌中含有多种EBPs，例如在大肠杆菌(Escherichia coli)中有13种EBPs，大多数与碳氮源代谢相关^[6-7]；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中有22种EBPs，参与的代谢途径很广泛，包括鞭毛合成、不同种碳氮源利用和藻朊酸盐生物合成等^[8]；枯草芽胞杆菌中有5种EBPs，调控精氨酸、支链氨基酸等碳氮源代谢^[9-12]。这些转录因子在许多生理代谢途径中具有重要作用，如NtrC调控氮源代谢^[13]、XylR调控芳香烃代谢^[14]、PspF调控内膜压力^[15]等。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis，Bt)是革兰氏阳性细菌，其在芽胞形成的同时能够产生杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，对多种鳞翅目和鞘翅目等昆虫都有特异性的毒杀活性，是应用最为广泛的微生物杀虫剂^[16-17]。本实验室前期研究发现，在Bt HD73菌株中有8种EBPs^[18]，调控多种代谢途径，包括γ-氨基丁酸代谢^[19-20]、赖氨酸代谢^[21]、肌氨酸代谢^[22]等，其中BkdR调控bkd基因簇的转录，可能与支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的代谢相关^[18]。

细菌中，支链氨基酸降解代谢形成的产物参与细胞重要的生理功能，例如支链氨基酸可降解成支链脂肪酸，在链霉菌(Streptomyces avermitilis)中^[23]，是聚酮化合物抗生素生产的一些前体的唯一来源；在Bs中，支链脂肪酸参与芽胞形成过程中细胞膜的形成^{[10, 24]}；在粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中，参与ATP和能量代谢^[25]；在黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)中参与细胞发育过程中的信号传导^[26]。Bs中，从支链氨基酸降解成支链脂肪酸的代谢途径由bkd基因簇编码的酶系统催化，bkd基因簇的转录受Sigma54因子控制，并受转录因子BkdR和全局调控因子CodY的调控^[10]。本实验室前期研究发现，Bt中bkd基因簇的基因组织和转录调控模式与Bs相似，bkd基因簇由8个基因组成，其中ptb-bkdB 7个基因形成一个转录单元，bkdR单独形成一个转录单元。bkd基因簇启动子Pptb的转录活性受Sigma54控制，并受BkdR正调控。Bt中bkdR基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无影响，但使菌体运动能力减弱^[27]。本研究在此基础上，对bkd基因簇启动子Pptb的诱导转录活性的调控机制进行深入分析。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和细菌培养条件: 所用菌株和质粒见表 1。大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)的培养使用LB培养基，培养条件37 ℃、220 r/min；Bt的培养分别使用LB培养基、SSM培养基^[28]和M9培养基(购自Sigma公司，货号：M6030)，培养条件30 ℃、220 r/min。抗生素使用终浓度分别为：氨苄青霉素100 μg/mL，红霉素5 μg/mL，卡那霉素100 μg/mL。

1.1.2 主要仪器和材料: 限制性内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司和北京博迈德科技发展有限公司；质粒提取、DNA回收和PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司。镍亲和层析柱填料购自GE公司。poly(dI:dC)购自Sigma公司。Gel Shift Assay Systems购自Promega公司。

1.1.3 引物合成及序列测定: 根据Bt HD73基因组序列^[30]设计引物，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部完成，序列测定由北京诺赛基因基因组研究中心有限公司完成，引物名称及序列见表 2。

1.2 ccpA突变菌株构建及筛选

为了研究CcpA对bkd基因簇的转录调控，利用同源重组的原理，构建了ccpA突变体，方法见参考文献[31]。简述如下：以Bt HD73基因组为模板，用引物ccpA-A1/ccpA-A2扩增ccpA基因上游片段(ccpA-A)，大小为618 bp；用引物ccpA-B1/ccpA-B2扩增ccpA基因下游片段(ccpA-B)，大小为646 bp。以△bkdR突变体^[27]为模板，用引物Kan-1/Kan-2扩增卡那抗性基因(kan)，大小为1503 bp。以ccpA-A、ccpA-B和kan为模板，用引物ccpA-A1/ccpA-B2通过重叠PCR扩增ccpA缺失突变盒(含有卡那霉素抗性基因)。PCR产物经限制性内切酶Bam HI和EcoR I双酶切后，连接到温敏穿梭载体pMAD，转化至大肠杆菌TG1菌株中，获得重组质粒命名为pMADΔccpA。将重组质粒转入ET去甲基化，再电击转入HD73菌株，转化方法见文献[32]，获得具有红霉素抗性的HD (pMADΔccpA)菌株。该菌株进行38 ℃高温突变，筛选出有卡那霉素抗性并且没有红霉素抗性的菌株，进行PCR鉴定：以ccpA-A1/ccpA-B2为引物，以具有卡那霉素抗性并且无红霉素抗性的菌株为模板，获得的突变菌株命名为HD(ΔccpA)。

1.3 BkdR表达菌株构建

根据GenBank中Bt HD73菌株(GenBank登录号：CP004069)的bkdR(HD73_4469)基因序列及pET21b质粒的酶切位点，设计扩增bkdR基因ORF的引物bkdR-F和bkdR-R (表 2)，以HD73基因组为模板扩增bkdR基因(2040 bp)，PCR产物纯化后经Bam HI和Sal I双酶切，连接含有His标签的pET21b质粒Bam HI和Sal I双酶切片段上，转化E. coli TG1菌株，获得重组质粒pETbkdR。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定，转化至E. coli BL21(DE3)菌株，获得表达菌株BL21(pETbkdR)。

1.4 蛋白表达纯化与凝胶迁移实验

BkdR蛋白和CcpA蛋白的表达与纯化见文献[29]。以Bt HD73为模板，用带有FAM (羧基荧光素)标记的引物(表 2)扩增Pptb片段(345 bp)。凝胶阻滞实验(EMSA，Electrophoresis mobility shift assays)确定Pptb片段与BkdR蛋白和CcpA蛋白的结合，方法见文献[29]。

1.5 β-半乳糖苷酶活性测定

Bt菌株过夜活化，1%转接至50 mL LB培养基，30 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀=2.0)，取1 mL菌液加入到100 mL M9培养基(含有终浓度为17 mmol/L的葡萄糖)，30 ℃、220 r/min振荡培养至OD₆₀₀=0.1 (约3 h)，分别加入终浓度为3 mmol/L的氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，继续培养2 h后开始取样(记为A2)，每2 h取样1次，共取9个点，每次取样10 mL，离心收集菌体，保留沉淀，β-半乳糖苷酶活性测定见参考文献[22]，每组数据至少独立重复3次。

2 结果和分析 2.1 bkd基因簇的诱导转录活性分析

为了研究bkd基因簇的诱导转录活性，构建了bkd基因簇的启动子Pptb融合lacZ基因的表达载体pHTPptb，分别电击转入Bt HD73菌株和bkdR突变体，获得菌株HD(Pptb)和ΔbkdR(Pptb)。β-半乳糖苷酶活性测定表明，在分别含有3 mmol/L亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的M9培养基中，Pptb启动子在Bt HD73出发菌株中的转录活性明显高于不含氨基酸的M9培养基[图 1-A，HD(Pptb)]，说明在基础培养基中，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸可诱导Pptb的转录活性。而在含有3 mmol/L亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的M9培养基中，Pptb启动子在bkdR突变体中的转录活性均显著下降[图 1-B，ΔbkdR(Pptb)]，说明Pptb的诱导转录活性受BkdR的正调控。

2.2 BkdR对bkd基因簇的转录调控作用

为了进一步明确BkdR对bkd基因簇的转录调控作用，构建Bt HD73菌株的BkdR表达纯化载体，PCR扩增bkdR基因全长并与含有His标签的pET21b载体连接，转化E. coli TG1菌株，获得重组质粒pETbkdR，经PCR鉴定得到2040 bp的条带(图 2-A)，经Bam HI和Sal I双酶切鉴定得到5.4 kb大小的载体条带和2040 bp左右大小的目的片段条带(图 2-A)，经测序分析和序列比对表明重组质粒pETbkdR构建正确。重组质粒转化至E. coli BL21菌株，获得BL21(pETbkdR)表达菌株，经IPTG诱导表达，超声破碎细胞，离心收集可溶性组分，对BkdR-His融合蛋白进行Ni²⁺螯合琼脂糖亲和纯化，SDS-PAGE结果表明所得蛋白纯度较高，分子量大小约为77 kDa (图 2-B)。

利用FAM标记的引物Pptb-1和Pptb-2扩增bkd基因簇的启动子片段(Pptb，345 bp)，与纯化的BkdR-His蛋白进行体外结合实验，结果表明(图 3)，凝胶底部的条带为20 ng带标记的自由DNA，上层为DNA与蛋白结合的条带，随着BkdR蛋白浓度的增加，底部未结合的DNA条带浓度越来越低，上层与蛋白结合的条带浓度逐渐升高，说明Pptb与BkdR蛋白有结合作用；而加入500倍浓度非标记的DNA可以与标记的DNA产生竞争作用(图 3，lane 7)；阴性对照为20 ng cwlC基因^[33] (cwlC基因编码母细胞水解酶，其转录受SigmaK因子控制)的启动子与0.37 μg BkdR蛋白无结合作用(图 3，条带8)。以上结果说明Pptb与BkdR蛋白具有特异性的结合作用，这些结果表明Pptb的转录受BkdR的直接调控。

2.3 CcpA对bkd基因簇的转录调控作用

前期研究表明，Pptb序列中包含一段序列(TTGAATGCGTTTTCA)与受CcpA调控的一致序列(WTGNAANCGNWNNCW)相似，为了明确CcpA是否对Pptb的转录有调控作用，构建了ccpA突变体，并将Pptb融合lacZ基因的表达载体pHTPptb电击转入ccpA突变体中，获得菌株ΔccpA(Pptb)。β-半乳糖苷酶活性测定表明，在SSM培养基中(图 4-A)，HD(Pptb)菌株与ΔccpA(Pptb)菌株的转录活性无明显差异；而在含有葡萄糖(17 mmol/L)和3 mmol/L氨基酸的M9培养基中(图 4-B，C，D)，ΔccpA(Pptb)菌株的转录活性显著高于HD(Pptb)菌株的活性，这些结果说明，在葡萄糖培养基中，Pptb的诱导转录活性受CcpA的负调控，而在普通培养基中，Pptb的基础转录活性不受CcpA的调控。

为了进一步明确CcpA对Pptb是否存在直接调控作用，应用前期构建的CcpA表达菌株BL21(pETccpA)^[29]，经IPTG诱导表达和Ni²⁺螯合琼脂糖亲和纯化，获得CcpA-His融合蛋白。利用FAM标记的引物Pptb-1和Pptb-2扩增得到的bkd基因簇的启动子片段(Pptb，345 bp)，与纯化的CcpA-His蛋白进行体外结合实验，结果表明(图 5)，底部带标记的20 ng自由DNA条带浓度越来越低，上层DNA与蛋白结合的条带浓度逐渐升高，说明Pptb与CcpA蛋白有结合作用，而加入500倍浓度非标记的DNA可以与标记的DNA产生竞争结合作用(图 5，lane 7)，说明Pptb与CcpA蛋白具有特异性的结合作用，这些结果表明Pptb的转录受CcpA的直接调控。

3 讨论

本实验室前期研究发现，Bt HD73菌株中bkd基因簇的启动子Pptb的转录受Sigma54因子的控制，并受BkdR的正调控^[27]，本研究进一步发现，Pptb的转录受亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的诱导，该诱导活性受BkdR直接调控，这种调控模式与Bs中的bkd基因簇的转录相似^[10]。本研究通过EMSA实验，进一步明确了纯化的BkdR蛋白和CcpA蛋白与Pptb启动子均存在结合作用，为bkd基因簇的转录调控机制提供了新的证据。BkdR蛋白是增强子结合蛋白，具有3个典型的结构域(图 6-A)：N端的PAS信号结构域，可能与识别亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸信号有关；中间的AAA⁺结构域，具有保守氨基序列GAFTGA，可能与Sigma54因子进行相互作用；C端的HTH结构域，可能识别Pptb启动子上的回文序列(图 6-B)并与之相结合。Pptb启动子序列中存在一个典型的受Sigma54控制的保守–12/–24序列(图 6-B)，Sigma54可能通过与该序列结合从而起始转录。Pptb启动子序列还存在一个CcpA识别的保守序列，CcpA可能通过与该序列结合从而起到调控功能。

本研究通过EMSA实验和β-半乳糖苷酶活性分析实验表明，在葡萄糖培养基中，bkd基因簇的诱导活性受CcpA的直接负调控，而在Bs中，没有相关报道显示bkd基因簇的转录与CcpA相关，通过在DBTBS数据库(http://dbtbs.hgc.jp/)中检索Bs 168菌株基因组中ptb基因上游启动子序列的转录调控因子结合位点，也没有发现与CcpA结合的cre位点。但是Bs中与支链氨基酸生物合成相关的ilv-leu操纵子受CcpA的调控。ilv-leu操纵子编码酶系统参与催化从丙酮酸到支链氨基酸的生物合成，将碳代谢与氨基酸合成偶联起来^[34-35]。在Bt中，CcpA可能调控了支链氨基酸的合成及降解代谢过程。