平菇，学名Pleurotus ostreatus (Fr.) Kummer，亦称糙皮侧耳，是世界主要的食用菌栽培品种，并可利用多种农业废弃物进行栽培^[1-2]。平菇味道鲜美，其含有丰富的多糖、维生素、蛋白质和矿物质，具有改善人体新陈代谢、增强体质、调节神经功能等作用，对肝炎、胃肠疾病、软骨病、高血压、夜盲症等皆有疗效，可以降低血胆固醇和防治尿道结石，对妇女更年期综合症也具一定的调节作用^[3-5]。

优良食用菌品种是食用菌产业健康和快速发展的关键。食用菌育种方法主要包括野生菌株的驯化、杂交育种和诱变育种。前两个方法都属于常规方法，选育周期较长、操作较为繁琐，而诱变育种则可以创造出一些新性状，且选育周期较短，可以选育出性状优良的食用菌品种。诱变育种方法根据使用诱变剂的种类可分为物理诱变和化学诱变。物理诱变使用的诱变剂主要包括紫外线^[6-7]、钴60 (⁶⁰Co-γ射线)^[8-9]、宇宙射线等^[10]。

⁶⁰Co是金属钴的一种放射性同位素，是强γ射线源，当γ射线辐射受体生物后导致DNA结构发生改变，进而导致受体生物发生突变。⁶⁰Co辐射诱变可以获得较高的突变率和较宽的突变谱，同时还有利于筛选新的突变型。目前，医药行业中所需的抗生素高产菌株基本上都是通过⁶⁰Co诱变得到的^[11-12]。最初，⁶⁰Co只是应用在食药用菌的保鲜储藏方面^[13]，也有用于提高子实体中维生素D含量的研究^[14-15]。Zhu等利用⁶⁰Co诱变选育出16株可以耐受低温的草菇突变株^[9]。李前红等利用不同剂量的⁶⁰Co辐照双孢蘑菇孢子，筛选得到12株优良突变株，选育出4株高产菌株^[16]。

诱变后的菌株需要进行进一步的鉴定才可进行下一步的研究和利用。研究人员往往利用食药用菌的菌丝拮抗试验^[17]、同工酶分析^[18]、分子标记技术[AFLP (amplified fragment length polymorphism)、SSR (simple sequence repeat)等]来验证诱变材料是否已经发生突变^[19]。但是拮抗试验和同工酶分析都各自有一些缺点，受影响的因素很多，其中，不同品种的食用菌的拮抗反应不一，且亲缘关系较近的菌株难以通过拮抗试验来区分。同工酶分析受环境干扰较大，结果不稳定。而SSR分子标记技术已经广泛应用于动植物种质资源鉴定中。

本文通过⁶⁰Co-γ射线诱变平菇原生质体悬浮液，通过拮抗反应进行初步筛选，再利用SSR分子标记技术鉴定突变菌株，并构建突变菌株的分子身份证^[20-21]，通过出菇试验确定其农艺性状和生长特性。目前，尚未见到有关平菇⁶⁰Co诱变育种的任何报道，因此本文对于食用菌诱变育种研究具有重要意义。

1 材料和方法 1.1 供试菌株

平菇菌株：灰美2号，为吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心保藏菌株。

1.2 诱变处理

挑取活化后平菇菌丝体放入30 mL MYG液体培养基(maltose yeast glucose liquid medium，自配)中，置于25 ℃、140 r/min的振荡培养箱中培养，菌丝体经溶壁酶酶解后，用0.6 mol/L的甘露醇稀释到1×10⁶个/mL，将制备好的平菇原生质体悬浮液置于⁶⁰Co-γ射线放射源下，辐射条件为0.9、1.2、1.5 KGy，剂量率为10 Gy/min。

1.3 突变菌株的初步筛选

⁶⁰Co-γ射线辐照结束后，将处理过的原生质体悬浮液涂布于含有0.6 mol/L的甘露醇的MYG再生培养基中，扩置于25 ℃的培养箱中培养。5 d后取出进行观察并统计致死率，致死率(%)=诱变处理后再生的单菌落数/未处理再生的菌落数× 100%。

挑取再生的平菇单菌落于PDA (potato dextrose agar)试管中，并进行编号，称为第1代诱变菌株；待第1代诱变菌株长满斜面后，再挑取菌丝尖端到1个新的PDA试管中，以此循环，共转接5代，找出性状相对稳定的菌株，再将诱变菌株利用DAPI进行核染色，通过荧光显微镜观察细胞核数量，并利用显微镜观查诱变菌株的菌丝是否具有锁状联合，筛选出双核菌株作为后续试验材料。将筛选到的诱变处理双核菌株与出发菌株(CK)分别接种在平板中，测量菌丝生长速度，观察和记录菌株的生长情况。

再分别将诱变菌株和CK置于同一PDA平板上，25 ℃避光培养6 d，观察和记录两接种块交界处的拮抗现象，初步筛选发生突变的平菇菌株。

1.4 利用SSR分子标记筛选突变菌株

根据本实验室针对平菇的转录组数据，筛选出的9对特异性平菇SSR引物对突变菌株的多态性进行检测，分别构建诱变菌株的分子身份证，用以检测诱变菌株的突变情况。平菇SSR引物具体信息见表 1，引物交由北京鼎国生物技术公司合成。

(1) 采用SSR法进行诱变菌株的筛选：以普通平菇(CK)和诱变菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20 μL反应体系中分别加入10×PCR buffer (Mg²⁺) 2 μL，2 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U Taq DNA polymerase 0.2 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL。使用BioRad PCR仪进行DNA扩增，具体步骤为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，32个循环；72 ℃ 10 min。

(2) 将步骤(1)制得的PCR产物稀释5倍后，通过LabChip GX Touch生物大分子分析仪进行检测，并对电泳产物条带进行分析，通过特异性条带进行聚类分析，并构建不同菌株的分子身份证以鉴别不同的诱变菌株。根据带型转换成0-9数值(在同一引物所扩增出的条带，带型一致的均为1，出现的第二种类型条带为2，第三种类型为3，以此类推，第十种类型为0)，以此数字构建菌株的分子身份证。

利用9对SSR引物电泳后得到的多态性条带转换成0-1数值(有条带记为1，无条带记为0)，将得到的0-1数值表录入Excel表中，利用生物统计软件NTsys 2.10将之前统计的数值进行0-1型变量聚类分析，得到平菇突变菌株的UPGMA聚类图。

1.5 对筛选到的突变菌株进行出菇试验

栽培料参照普通平菇的栽培配方：杂木屑78%，麦麸20%，蔗糖1%，碳酸钙1%，料水比1.0:1.8，每袋湿料1.0 kg，121 ℃灭菌85 min，冷却室温备用。置于智能化出菇房进行出菇管理，记录菌丝满袋时间，原基形成时间，出菇时间；调查子实体农艺性状，包括菌盖长径、菌盖短径、菌柄长度和直径、菌盖厚度、菌盖颜色、产量。

2 结果和分析 2.1 诱变剂量的筛选

根据诱变处理5 d后再生的单菌落数量统计不同剂量处理的致死率，发现0.9 KGy的诱变处理致死率为0%，1.2 KGy的诱变处理下菌株致死率63.33%，1.5 KGy的诱变处理下菌株致死率为76.67%。将转接5代后鉴定为双核菌株的单菌落转出培养7 d后，发现不同诱变剂量下的菌株生长态势各不相同，0.9 KGy的诱变处理菌株菌丝生长有所抑制，表面呈淡红色，菌落不规整。1.2 KGy诱变处理的菌株菌丝生长速度约为出发菌株的一半，菌落形态不规整，表面淡红色，菌落稀疏。1.5 KGy的诱变处理的菌株菌丝生长速度更慢，菌落形态也不规整，表面也呈淡红色，菌落稀疏。1.2 KGy接近于平菇菌株的半致死剂量，可作为平菇⁶⁰Co诱变育种使用的剂量，具体结果如表 2。

2.2 突变菌株的筛选

将诱变后转板活化后5代的菌株与出发菌株进行拮抗试验，发现8个菌株与出发菌株有不同程度的拮抗现象，分别命名为1.2-P1、1.2-P2、1.2-P3、1.2-P4、1.2-P5、1.2-P8、1.5-P2、1.5-P4，初步确定为诱变得到的突变平菇菌株(表 3)。

经拮抗试验鉴定出的突变菌株经SSR鉴定结果表明，8个诱变菌株在9对引物的扩增下呈现出不同的特异条带，表明这些菌株发生了突变，根据各个引物下的带型分别构建了9个菌株(包含CK)的分子身份证，部分结果见图 1。构建原则如下，每个菌株的分子身份证由9位数字组成，分别对应上述的9对SSR引物，不同数字代表引物扩增出带型在标准扩增图谱中的编号，9位数字从左到右的顺序对应的引物顺序依次分别是引物148、引物82、引物240、引物212、引物194、引物251、引物13、引物243、引物239。以CK为例，其分子身份证ID为111111111，表示在上述引物顺序下第1对引物的第1种带型，第2对引物的第1种带型，第3对引物的第1种带型，依此类推。结果表明各个突变菌株在9对引物下构成的分子身份证均不同于出发菌株，利用聚类分析软件分析后表明，在0.91处8个突变菌株可与CK分开，其中1.2-P2和1.5-P2聚类到一起，二者分子身份证也一样，表明二者突变位点相同或者相近，详见表 4和图 2。

2.3 突变菌株农艺性状的变化

出菇试验结果表明，突变菌株1.2-P1的产量较对照菌株提高了9.76%，生物学效率较CK提高了10.38%，其菌丝生长速度快于对照2.70%，但生育期延长了4 d，其菌盖长径、菌盖厚度、菌柄直径、菌柄长度均要大于对照。其他突变菌株的产量都接近或者低于对照菌株，其中突变菌株1.5-P4的产量较对照降低了41.92%，生物学效率降低了44.61%，产量下降的另一个原因是其只出了两潮菇，此外该菌株在菇蕾期，其菇蕾数量剧增，明显高于对照，但子实体形成后菌盖明显小于对照。具体结果如表 5、图 3和图 4所示。

3 讨论

刚诱变后的菌株均出现不同程度的损伤情况，表现为生长速度降低^[22]，菌落形态不规则，并有色素分泌，菌丝呈淡粉色。这一时期的菌株由于刚刚接受了高剂量的辐射，细胞和细胞内的遗传物质均受到损伤，遗传物质有可能发生了一定的突变，受伤的细胞作出了一定的应激反应。转接出的诱变菌株在培养7 d后，部分菌株直接死亡，表现为菌丝块发黑，没有任何生长迹象。本试验设置的剂量梯度，还没有探索出试验菌株的致死和半致死剂量，这需要在后续的试验中增加诱变剂量梯度。为了让诱变后的菌株恢复其基本活性，我们将存活后的菌株分别转接了5代，以期获得性状稳定的突变菌株，使突变菌株的细胞受损情况得以恢复，可用于菌株生长性状的观察和后续试验。转接5代后的菌株菌落形态逐步趋于正常^[23]，只是生长速度和菌落形态与出发菌株有差异。

拮抗现象广泛存在于各种丝状真菌中^[24]，不同的物种或者品种在同一菌板生长时，在菌丝接触处会出现拮抗现象，由于体细胞不亲和性，表现为分泌特殊化学物质，菌丝弯曲和排斥，在两个菌株菌丝交接处产生一定程度的拮抗线^[25]。利用拮抗现象可以作为突变菌株的初步筛选的方法，并根据拮抗的强弱来鉴定亲缘关系的远近，此方法已广泛用于丝状真菌亲缘关系的鉴定^[26-27]。由于突变菌株从出发菌株诱变得到，大部分遗传物质可能没有发生变化，8个突变菌株与出发菌株的拮抗现象不明显，但菌落形态与对照有差异。然而不同的食用菌品种拮抗现象表现不同^[28]，个别食用菌品种在自身菌株进行接种时候，也会表现出一定的拮抗现象，所以我们不能单独以拮抗试验作为突变菌株的筛选方法。本文利用本实验室依据转录组数据筛选好的9对平菇特异性SSR引物，用于突变菌株的鉴定和分子身份证的构建，结果表明所用引物可将9个菌株分开。

结合之前的结果，8个突变菌株中有6个是1.2 KGy诱变出的，2个是1.5 KGy剂量下诱变得到的。可见，1.2 KGy较为适合作为平菇⁶⁰Co诱变育种的诱变剂量。

鉴定出来的突变菌株，只有筛选出具有优良性状或者特定性状的菌株才能够利用。出菇试验发现，除了1.2-P1的产量高于出发菌株，其余7个突变菌株产量均低于对照。可见，物理诱变育种导致菌株产生不定向的突变，有的菌株能够出现优良的性状，有的菌株出现较差或者无用的性状，这就需要我们加大诱变菌株的数量，加大选择力度，才能从大量诱变菌株筛选出优良的突变菌株。

同时，我们发现幼菇数量剧增的突变菌株1.5-P4，这个菌株可以作为选育优良平菇新品种的基础材料。当然，产量是品种选择的一个重要育种目标，但不是唯一的目标，选育生育期短、抗病性好、品质优良、品相好或者易保存的菌株都是我们食用菌育种的目标^[29]。此外，在以往的研究中有些突变菌株产生了一些较差的性状，这些性状可以作为杂交育种的亲本材料，或者利用分子标记技术定位控制农艺性状的位点^[29]，通过杂交选育一些特定性状的食用菌品种^[30]，可为食用菌产业的发展提供更多的种质资源。