近期，细胞焦亡作为一种细胞程序性死亡方式得到越来越多的关注。当机体受到细菌、病毒等病原微生物感染时，体内吞噬细胞如巨噬细胞、中性粒细胞可识别并清除感染物质。当宿主识别自身受损部位启动先天性免疫应答过程时则会触发细胞坏死、凋亡或焦亡。细胞焦亡是由炎症小体参与的依赖炎性半胱氨酸酶(caspase)的一种新的细胞程序性死亡方式。焦亡细胞同时具有凋亡和坏死的细胞特征，主要表现为Annexin V染色阳性，细胞核皱缩、细胞膜成孔，进一步导致细胞肿胀破裂、释放细胞内容物，分泌炎性细胞因子，引起炎性反应。因此细胞焦亡又称为细胞的炎性坏死^[1]。在感染过程中，机体可通过激活炎症小体，进而切割半胱氨酸酶-1(caspase-1)使其活化，活化的caspase-1切割gasderminD (GSDMD)，使其在胞膜上形成gasdermin孔；同时活化的caspase-1可切割IL-18和IL-1β的前体产生成熟的IL-18和IL-1β，从gasdermin孔流出，引起炎症反应。细胞内外物质通过gasdermin孔进行交换，使细胞体积增大，导致膜破裂，完成清除感染细胞，破坏病原体的免疫应答过程，且焦亡过程还可清除已逃避炎症小体识别的感染细胞。例如，鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生性李斯特菌引起宿主感染时，可通过表达特殊的鞭毛蛋白逃避宿主炎症小体的识别，从而在巨噬细胞内快速繁殖，引起更严重的感染过程^[2]。焦亡通过使细胞破裂来杀死感染细胞，而存在于细胞内已修饰过的细菌并没有因细胞裂解被杀死，它们仍存在于已焦亡的细胞的某个结构中，该结构称为孔诱导胞内陷阱(pore-forming intracellular trip，PIT)^[3]。在细胞焦亡过程中，破裂的感染细胞转化为PIT，而PIT将质膜完整的细胞器和胞内活菌捕获在其内部，含菌的PIT增加了中性粒细胞趋化因子的数量^[4]，损伤相关分子模式(damage associated moleculer pattern，DAMP)和类花生酸等，使中性粒细胞或可能产生活性氧的巨噬细胞通过吞噬PIT来杀灭其中的细菌^[5]。

多名学者在研究焦亡过程中也曾推测在caspase-1/11的下游存在一种底物，该种底物具有膜成孔的活性。有实验室证明^[6]在细胞焦亡的非经典途径中，使用致死剂量的LPS刺激GSDMD敲除的骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrohpage，BMDM)，BMDM并未出现焦亡现象，且成熟的IL-1β分泌明显减少，证实GSDMD在caspase-11介导的非经典焦亡途径中发挥作用。

1 GSDMD在细胞焦亡途径中的作用机制 1.1 GSDMD及其家族成孔活性机制

Gasdermin家族具有45%序列同源性，包括gasderminA、B、C、D、E、DFNB59。除DFNB59缺失具有成孔活性的结构域以外，大部分都具有成孔活性^[7]，且仅在成孔结构域(pore-forming domain，PFD)与抑制结构域(repressing domain，RD)间存在不同的连接物，而PFD是功能结构域，可诱导细胞焦亡，并形成PIT。

研究表明，GSDMD可在免疫细胞和肠上皮细胞中表达^[8]，由含242个氨基酸的氨基末端结构域(即N端结构域，gasdermin端，NT)通过一个含43个氨基酸的连接物与含199个氨基酸的碳末端结构域(即C端，CT)组成。NT可以形成gasdermin孔^[9]，因此NT也称为PFD。但通常成孔活性被C端抑制，因此C端也称为RD。早先研究^[10]发现了GSDMA3的晶体结构，其与GSDMD结构有高度相似性，该结构揭示了一个自我抑制机制。近期，该自抑机制得到进一步研究^[11]：gasdermin-N端具有延伸的β-折叠的核心结构，gasdermin-C端为α4-螺旋球状褶皱，带有caspase切割位点的连接物通过一个口袋样结构将两个结构域末端结合在一起。在细胞焦亡过程中，caspase-1或caspase-4/5/11被激活，活化的半胱氨酸蛋白酶在第275个氨基酸的位置切割连接物。当连接物被切割后，α4-螺旋从口袋样结构中释放，使NT与CT断开，解除自抑制结构。NT的成孔活性由此激活，大约16个PFD单体寡聚化可在细胞膜上形成一个直径在10-15 nm的孔^[12]，最终引起膜肿胀破裂。在焦亡过程中，被caspase-1切割后的成熟IL-1β、IL-18也可通过gasdermin孔流出细胞，因而该孔也可作为蛋白质分泌通道。此外，GSDMD-NT还可作用于线粒体，使线粒体产生较多的ROS，ROS进一步作用于炎症小体，激活其下游途径，引起促炎物质的分泌，起到免疫防御的作用^[13]。GSDMD中成孔结构域PFD可被caspase-3切割并失活，因而一旦caspase-3启动细胞凋亡，则会抑制细胞焦亡^[14]。

1.2 GSDMD孔介导两条细胞焦亡途径

细胞焦亡途径分为两种，由caspase-1介导的经典细胞焦亡途径和由caspase-11 (人类同源的炎性半胱氨酸蛋白酶为caspase-4/5)介导的非经典细胞焦亡途径。细胞受到不同刺激时，可激活不同的半胱氨酸蛋白酶，如LPS激活caspase-11，ATP、细菌鞭毛、孔形成毒素等可激活caspase-1，最终caspase酶均通过切割GSDMD蛋白，解除它的自抑制结构，启动细胞焦亡通路^[15-16]。两种途径不同之处在于，caspase-1不仅可切割GSDMD蛋白，还可切割pro-IL-1β，形成成熟的IL-1β；而caspase-11仅切割GSDMD蛋白，使胞膜成孔，刺激K⁺流出，进而激活NLRP3炎症小体，活化caspase-1，产生成熟的IL-1β。

在焦亡途径中有两个关键成分，炎症小体和GSDMD。LPS、细菌、病毒等病原相关分子模式和ATP等损伤相关分子模式均可激活炎症小体。炎症小体由多个蛋白构成，其中包括NLR蛋白、接头蛋白ASC和炎性半胱氨酸蛋白酶-1蛋白^[17]。炎症小体通过NLR蛋白识别上游信号后，活化caspase-1，将信号传递至下游执行蛋白GSDMD，其N端的抑制结构被解除，在细胞膜上形成gasdermin孔。该孔打破了正常质膜的渗透屏障，中断正常钠、钾离子交换，由浓度梯度驱动的力量使钾离子流向细胞外去中和电子，钠离子也依靠其浓度梯度和电梯度被大量吸引进入细胞，进而使大量水进入细胞，导致细胞体积增大。

若细胞膜上存在少量gasdermin孔，细胞则会启动补偿机制去减小细胞体积。其中包括由于细胞肿胀激活的K⁺、Cl^-通道，该通道可促进胞内溶质及水流出细胞^[18]。且细胞内高尔基体被激活，发挥紧急胞吐作用，胞吐小泡的膜与细胞膜融合，修补含孔的膜，则不会进一步引起细胞焦亡^[19]。若细胞膜仍存在大量gasdermin孔，则细胞补偿机制失效，细胞体积继续增大。一旦体积增大到超过细胞膜承受能力，胞膜分离，形成一个个充满液体的小体，此后细胞膜破裂，触发细胞焦亡，大量内容物及白介素释放至细胞外，扩大炎症反应^[3]。此外，在细胞焦亡期间，caspase-1切割GSDMD同时切割IL-1β及IL-18前体，以在细胞膜破裂之前产生成熟细胞因子。IL-1β (4.5 nm)和IL-18 (5.0 nm)可通过gasdermin孔(10-15 nm)释放到胞外^[12]，这也解释了在细胞裂解前可在胞外观察到IL-1β和IL-18的现象^[11]。

1.2.1 经典细胞焦亡途径: 最初研究认为^[20] NLRP3可被ATP和某些细菌毒素直接激活。经过深入探讨发现这些微生物产物，内源性分子和颗粒物并不是直接激活该通路^[21-23]，而是通过激活Toll样受体(Toll like receptor，TLR)等来激活NLRP3^[24]，进而活化下游分子。目前He等^[25]提出的NLRP3激活的双信号模型已被接受。在该模型中，一信号启动是通过TLR等受体接受微生物或内源性分子刺激，激活NF-κB通路，诱导NLRP3活化及pro-IL-1β表达；二信号是通过ATP、成孔毒素、病毒RNA或颗粒物质等进一步激活NLRP3，随后NLRP3通过ASC与caspase-1连接形成一个多蛋白复合物，进而caspase-1发生自剪切过程形成活化的caspase-1，活化的caspase-1切割GSDMD以及白介素前体，使白介素前体变为有活性的白介素(IL-1β、IL-18)并解除GSDMD的结构自抑性，GSDMD-NT在细胞膜上成孔导致细胞焦亡，释放内容物及白介素引起炎症反应。本文通讯作者参与的研究发现，Syk和JNK参与调控ASC磷酸化过程，通过影响ASC斑点蛋白形成来调控NLRP3及AIM2炎症小体的活化^[26]。

1.2.2 非经典的细胞焦亡途径: 除caspase-1，鼠源巨噬细胞中caspase-11 (人源中的caspase-4/5)也可以在胞内作为受体特异性结合LPS。大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌和福氏志贺菌等多种革兰阴性菌的LPS通过TLR4递送到胞质中并激活caspase-11^[27]。活化的caspase-11可裂解GSDMD^[28-29]，使GSDMD的N端活化引起细胞焦亡；同时活化的caspase-11开启pannexin-1通道，诱导K⁺外流，激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β释放。此外，ATP还可通过被切割的pannexin-1区域以自分泌或旁分泌方式与P2X7受体结合，打开P2X7孔，促进焦亡^[30]。炎症小体虽参与了非经典途径，但并未直接参与细胞焦亡过程，而是通过炎性的半胱氨酸酶切割GSDMD，使其具有成孔活性而引起细胞程序性死亡。具体通路见图 1。

2 GSDMD在感染性疾病中的作用

在感染性疾病中，细胞焦亡是机体重要免疫防御机制，在清除病原体感染及内源性危险信号时发挥重要作用，也为疾病的治疗提供新的治疗靶位^[31]。

目前，已有多种研究证明炎症小体参与细菌的清除过程。例如产单核细胞李斯特菌，该菌是一种引起人畜共患病的革兰阳性细胞内寄生菌，它可以利用巨噬细胞的吞噬功能入侵宿主巨噬细胞，分泌李斯特菌溶血素介导细菌逃离吞噬体, 并在巨噬细胞胞浆内复制。进入胞质的产单核细胞李斯特菌可激活细胞内Ca²⁺信号通路，进一步诱导IL-1α成熟、分泌，启动机体免疫防御机制^[32]。本课题组证明^[33]，当产单核细胞李斯特菌感染小鼠巨噬细胞时，Syk可通过调控ASC-依赖的炎症小体的活化来调节IL-18的生成。且另有研究证明^[21]，在产单核细胞李斯特菌感染机体时，caspase-1可通过NLRP3-ASC途径被激活，将IL-1β和IL-18前体切割为有活性的IL-1β和IL-18，从而激活宿主产生免疫应答，引起炎性反应，且被杀死细胞呈现焦亡特征。本文通讯作者参与的研究^[34]还证明，AIM2炎症小体也参与了产单核细胞增生李斯特菌感染时caspase-1的活化。而在AIM2敲除组中，caspase-11被活化，同样也发生了焦亡现象，说明在AIM2不存在的情况下，还存在其他的补偿机制来执行焦亡信号^[35-36]。AIM2与NLRP3在李斯特菌感染巨噬细胞时共同发挥重要作用，他们是通过激活caspase-1/11来引起细胞焦亡。而焦亡发生是由GSDMD参与的。为了证实GSDMD在感染中的作用，刘星等^[9]构建了GSDMD-NT、4A-mutant GSDMD-NT、GSDMD-CT、GSDMD四种构建体，分别设立大肠杆菌感染组以及金黄色葡萄球菌感染组，5 min后发现GSDMD-NT组强烈抑制两种细菌的集落形成，说明GSDMD-NT具有抗菌作用。为了进一步确定GSDMD-NT是否还具有杀菌作用，研究人员再次用以上四种构建体处理了大肠杆菌感染组及李斯特菌感染组，20 min后，GSDMD-NT组中约80%的细菌被杀死。且用负染色电镜可观察到，只有当GSDMD与caspase-11同时存在并结合的情况下，才会出现细胞膜破裂的现象。

并且该研究^[9]还证明GSDMD-NT可结合含有心磷脂(存在于细菌膜的内外小叶中)、磷脂酰肌醇磷酸酯及磷脂酰丝氨酸(限于细胞膜内小叶)的膜，形成寡聚孔，将胞内物质释放到细胞外环境中。GSDMD-NT可选择性结合细胞膜内层的磷脂，因此在焦亡过程中只能从胞质内表面形成孔，并保护相邻正常细胞免受GSDMD对膜的成孔作用。GSDMD-NT还可限制活菌从感染细胞中释放并减少感染的扩散。由于吞噬体外小叶是来源于质膜的内部小叶，因此吞噬体还可被GSDMD-NT靶向，为吞噬体内细菌提供了条件。而GSDMD-NT是否仅对从吞噬体逃逸的细菌有活性还不清楚。

在金黄色葡萄球菌感染中，Miller等^[37]证明在缺乏IL-1R、IL-1β或ASC的小鼠中，皮肤感染部位嗜中性粒细胞明显减少，并且金黄色葡萄球菌在这些部位生长更快。随后Accarias等^[38]在研究中发现金黄色葡萄球菌感染时，其毒素可以触发依赖炎症小体的细胞死亡程序，呈现焦亡的所有特征。这一结果证实了金黄色葡萄球菌α-毒素激活巨噬细胞中炎症小体，使机体发挥免疫作用。Shimada等^[39]在研究中也发现巨噬细胞吞噬体中细菌细胞壁的降解与炎症小体的活化及IL-1β分泌有关，这将为金黄色葡萄球菌感染性疾病的诊疗提供新的靶标。

此外，在其他细菌感染过程中也被证明存在焦亡现象，如志贺杆菌，一种革兰阴性短小杆菌。早在1992年就有研究发现^[40]志贺杆菌可以诱导巨噬细胞发生程序性死亡。后来发现这种死亡方式是由caspase-1介导的，证明了这种程序性死亡并不是凋亡。随研究深入，有研究证明^[41]志贺杆菌诱导的细胞程序性死亡还伴随细胞膜通透性改变、核固缩、IL-1β分泌增多，具有细胞焦亡特征。近期研究发现^[42]，革兰阴性菌产生的脂多糖由一囊泡状结构包绕，该结构称为外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)。OMVs可通过内吞作用进入到胞质内，进而激活caspase-11，引起细胞焦亡。这也进一步说明了，非入侵的细菌也可以激活机体启动细胞焦亡免疫防御机制。

由此可见，GSDMD作为细胞焦亡途径中的主要执行者，在细菌感染性疾病中发挥着重要作用。它可在细胞膜上成孔，引起细胞内外物质交换，将炎性细胞因子分泌至细胞外，同时使细菌困于感染细胞中，从而被中性粒细胞等吞噬细胞清除。

除细菌感染可诱发细胞焦亡外，一些病毒感染^[43]，如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，也引起细胞焦亡。HIV感染可激活炎症小体。HIV可通过淋巴组织入侵静息的CD4⁺T细胞，并进行逆转录，此转录过程可被DNA传感器IFI16识别，从而激活炎症小体，进而活化caspase-1，引起细胞焦亡^[44]。然而GSDMD在此过程中发挥的作用还未得到进一步证实。

在真菌感染中，如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)也可观察到由caspase-1/11启动的免疫防御机制。烟曲霉^[45]可在THP1细胞中激活NLRP3炎症小体，在小鼠骨髓来源树突状细胞中激活AIM2和NLRP3炎症小体，进而分泌成熟的IL-1β、IL-18。然而在真菌感染过程中是否可以触发由caspase-1介导的GSDMD参与的细胞焦亡过程还需进一步研究。

3 细胞焦亡与其他细胞程序性死亡机制在感染性疾病中的相互作用

在机体感染过程中，焦亡作为一种程序性死亡方式，并不是单独发挥作用，而是与其他机制互相牵制来达到清除感染物质的目的。

3.1 凋亡与焦亡的相互作用

细胞凋亡是细胞程序性死亡方式之一，由细胞外死亡受体途径和细胞内线粒体死亡途径共同调节，坏死的溶解物质会引起细胞内损伤相关分子模式的释放，从而引起炎症。主要表现为细胞固缩、染色质和细胞质浓缩、核破裂，最终形成凋亡小体^[46]，被周围的巨噬细胞吞噬，导致细胞死亡。

目前很多研究发现，当机体不能有效清除凋亡细胞时，已凋亡细胞会进一步发生继发性坏死，表现为凋亡细胞的质膜完整性逐渐丧失的过程。继发性坏死一直被认为是自发不受调控的过程，但最近研究表明^[47]，DFNA5可被caspase-3切割，进一步引发凋亡细胞的继发性坏死。切割后的DFNA5 (GSDME)释放出N末端片段，使凋亡细胞的胞膜成孔，进而发生类似于细胞焦亡的细胞坏死。在化疗药治疗下，caspase-3切割DFNA5诱导的细胞死亡速度比细胞凋亡更快，且该实验室证明，GSDME在大多数癌细胞中的表达量明显低于许多正常组织。GSDME的表达水平是否决定细胞的死亡形式以及焦亡和凋亡后的继发性坏死如何调节，还需进一步研究。此外，当机体受到外源性刺激时，线粒体活性氧产生增多，引起JNK磷酸化，BaX蛋白产生增多，进而触发细胞凋亡。该途径也可引起caspase-3/9活化，从而切割GSDME，触发细胞焦亡，但细胞焦亡与细胞凋亡之间的相互关系尚不明确^[48]。细胞焦亡和细胞凋亡是否同时发生在感染性疾病中及相互作用关系尚需进一步探讨。

还有一项研究表明^[49]，在敲除了GSDMD的单核细胞中，LPS与尼日利亚菌素确实诱导细胞发生凋亡。且该实验室还证明炎症小体和caspase-1可激活caspase-3/7，从而阻断细胞焦亡。但激活caspase-3/7诱发的细胞死亡速度比切割GSDMD诱导细胞焦亡过程更慢。由此得出一个猜想，炎症小体和caspase-1激活caspase-3/7引起细胞凋亡后的继发性坏死不仅可以确保感染细胞被消除，还可作为反监管机制抑制细胞焦亡和炎症。因此焦亡与细胞凋亡间的相互作用还有待研究。

3.2 坏死性凋亡与焦亡的平衡作用

坏死性凋亡是细胞主动死亡过程，是依赖受体相互作用蛋白激酶1 (receptor-interacing protein kinase 1，RIPK1)及受体相互作用蛋白激酶3 (receptor-interacing protein kinase 3，RIPK3)磷酸化，使磷酸混合谱系激酶结构域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)寡聚化后激活的程序性死亡机制^[50]。在坏死性凋亡过程中，TNF受体1识别TNF (细胞凋亡和坏死性凋亡的诱导因子)，随后TNF受体1三聚化，募集衔接蛋白TRADD (通过DD相关的TNF受体)、TRAF2 (TNF受体相关因子2)和RIPK1形成复合体I (TRADD-TRAF2- RIPK1)。复合体I中几种组分重新形成细胞溶质复合体(也称复合体II)，并通过DD介导的相互作用募集FADD，随后FADD招募caspase-8而RIPK1招募RIPK3^[51]。RIPK1-RIPK3相互作用可招募更多RIPK3分子来促进R1PK3-RIPK3同源相互作用，并诱导RIPK3发生磷酸化^[52]，自磷酸化的RIPK3进一步使MLKL发生磷酸化，且MLKL的N端可直接与心磷脂或其他几种磷脂酰肌醇磷酸盐(PIPS)相互作用，利于与质膜融合。最新研究表明^[53]，磷酸化后的MLKL可形成八聚体结构，跨越质膜引起膜破裂，引起细胞溶胀和溶解^[54]。

当细菌感染机体后会产生孔形成毒素(pore- forming toxin，PFT)，MLKL在细胞膜上成孔并使细胞内容物释放到胞外引起炎症反应。与由caspase-1介导的细胞焦亡相似，坏死性凋亡也是通过释放胞内物质促进炎症的发生，但坏死性凋亡是由TLRs或TNFR或IFNAR受体识别病原物质来激活RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路引起的一种程序性死亡方式^[55]。Kitur等^[56]通过一系列实验表明，在感染过程中，焦亡促进了金黄色葡萄球菌的清除，而坏死性凋亡可促进被感染细胞的清除，从而抑制过量的炎症表达。他们通过建立小鼠感染模型以及化脓性感染模型证明在RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路中，MLKL可以清除感染部位的金黄色葡萄球菌，抑制RIPK1会破坏机体的清除能力并且加重炎症反应。RIPK3作为RIPK1的下游因子和坏死性凋亡的主要调控因子^[57]，它可以直接活化坏死性凋亡途径并刺激NLRP3炎症小体产生IL-1β^[58]，相反，通过抑制RIPK3减弱坏死性凋亡的作用，可增强金黄色葡萄球菌的清除，但这将引起更严重的炎症反应。并且研究发现^[59]当缺乏caspase-1/4时，会加重机体感染程度。caspase-1介导的细胞焦亡在感染中起到清除感染菌的作用，而体内存在的坏死性凋亡和细胞焦亡途径共同作用会提高感染后的生存率。最新报道提出，坏死性凋亡引起细胞死亡通过限制细胞因子的产生起到免疫抑制的作用^[60]。当机体感染时，过量的炎症反应反而会增加发病率和死亡率^[61]，因此坏死性凋亡是机体防御系统中限制炎症过表达的重要组成部分。

4 展望

细胞焦亡是一种依赖于caspase-1和/或caspase-11并且具有促炎性质的程序性细胞死亡，是机体在清除病原感染和收到内源危险信号刺激时的重要免疫防御反应。研究显示GSDMD是细胞焦亡过程中的关键物质，但其下游产物与细胞发生焦亡的关系仍有待研究。焦亡作为一种细胞的自我调控程序，是机体一种抵制内、外源刺激的有力机制，然而在某些条件下焦亡过度激活，反而会加重炎症反应，导致相关疾病的发生和发展。因此对于细胞焦亡影响因素及激活机制的深入研究，有助于进一步揭示细胞焦亡所涉及的分子机制，利于了解临床上与细胞焦亡相关疾病的发生机制，为相关疾病的治疗提供全新的药物靶点。