砒砂岩被称之为“地球生态癌症”，主要分布在内蒙古的准旗、伊旗、东胜、达旗及陕西省神木、府谷县的皇甫川、窟野河、清水川等流域，是黄河粗泥沙的主要来源^[1-2]。黄河问题的实质是泥沙问题，想要解决黄河的泥沙问题就要重视砒砂岩地区的水土流失问题，如何治理砒砂岩成为国家、科学界非常重视的问题，先后在砒砂岩地区开展了相关科研和治理，对于揭示砒砂岩地区水土流失的复杂机理、实施科学防治起到了积极作用^[3]。砒砂岩区土层营养匮乏，土壤含水量低，植被难以复原，植物“柔性坝”只能在砒砂岩侵蚀的沟底部进行种植，而对于坡面和沟坡的水土流失并不能达到理想的治理效果^[4]。因此，需要找到一种先锋植物在砒砂岩地区改良土壤，促进微生物多样性及物质循环，将生态效益、经济效益和社会效益紧密结合起来，在恢复生态的同时也获得经济效益和社会效益。

巨菌草(Pennisetum sp.)是被子植物门单子叶植物纲禾本科狼尾草属，于1983年由福建农林大学林占熺研究员从非洲引入中国，目前可以适应我国的气候环境^[5-6]。巨菌草植株高大直立、丛生，株高一般为3-5 m，根系十分发达，分蘖能力强，年产鲜草可达200 t/hm²以上^[7]。有研究表明巨菌草能明显提高荒坡地和沙质荒漠化土壤微生物群落功能多样性、土壤肥力和有机质含量，产生一定的生态正效益，已是多种生态脆弱区生态综合治理的先锋植物^[8-10]。也有研究表明巨菌草粗蛋白和多糖含量较高，可作为牛、羊、鸭、鸡等牲畜的饲料并能够提高肉质，带动畜牧业发展，经济效益明显^[11-13]。

土壤中的微生物种类众多，土壤是微生物最好的生存载体，为微生物的生存和发展提供了一个大环境，其数量和分布因土壤类型、土壤的含水量、pH值、有机质含量及季节等因素的影响而有所差异^[14-15]。目前对农田、林地和草地的土壤微生物菌群多样性研究较多，研究内容主要集中在土层深度、季节变化以及地域分布对它们数量和种类的影响，而对砒砂岩地区的土壤微生物研究甚少，巨菌草对砒砂岩地区的土壤基本理化性质及细菌多样性影响的研究则更是空白。

土壤中微生物数量巨大、群落结构复杂，现在的技术无法对所有的序列进行测序，第一代Sanger测序读取序列长，准确率高，能根据测到的全长16S rRNA基因序列注释到种，但是其缺点是测序通量较低，大规模测序成本高^[16]。Illumina MiSeq高通量测序技术，一般每个样品可以测定40000-60000个序列数，覆盖深度大，对物种多样性的分析非常有利^[17]。本研究采用Illumina MiSeq测序技术，能够更加深入、全面地分析砒砂岩地区土壤细菌多样性，探究巨菌草种植对细菌群落组成的影响。

1 材料和方法 1.1 实验区概况

项目试验区位于黄土高原丘陵沟壑区皇甫川流域——内蒙古自治区鄂尔多斯市准格尔旗暖水乡圪秋沟村，地理坐标为北纬39°46′-39°77′，东经110°40′-110°68′，此处为典型的砒砂岩区，覆沙、覆土、裸露三种类型并存，该区水土流失异常强烈，严重恶化了砒砂岩区的生态和农牧业生产环境，土地生产力低，农牧业经济落后，群众生活贫困。从20个世纪80年代至今，该区是国家重点治理和科学界关注与研究的热点区域。

1.2 主要仪器与培养基

主要仪器：分析天平、水浴锅、紫外可见分光光度计、隔水式恒温培养箱、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、分析天平、生化培养箱。

培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，琼脂18 g，蒸馏水1 L，pH 7.0-7.2。

1.3 土样采集与处理

当年4月初在三块试验地种植巨菌草，并分别在巨菌草种植前(4月初)、苗期(5月中旬)、分蘖期(7月初)、拔节期(8月中旬)、成熟期(10月)在三块试验地进行取样。按照“随机”、“等量”、“多点混合”的原则，在各试验区沿S形随机选取10个点，将地表 1 cm左右的表层土壤清除掉，在0-20 cm深度处等量采集土壤，取得的土壤放置在干净塑料布上以清除杂物，用四分法对角取两份混合放在塑封袋里，一个混合样品在1 kg左右，附上标签，注明采样地点、时间。

土壤样品收集完毕后带回实验室，将部分土样置于阴凉通风处风干处理，风干后过筛处理用于土壤理化性质的分析；另一部分置于4 ℃冰箱中用于土壤微生物数量的测定；少量土样置于-80 ℃超低温冰箱，用于高通量测序分析。

1.4 土壤基本理化性质的测定

1.4.1 土壤含水量测定: 称取10 g土壤样品于铝盒中，在105±2 ℃烘干至恒重时的失重，即为土壤样品所含水分的质量。

1.4.2 有机质测定: 采用低温外加热重铬酸钾氧化比色法^[18]。

1.4.3 pH测定: 用pH计测定(土水比为1:2.5)。

1.5 土壤可培养细菌的测定

称取10 g土壤样品，放入装有90 mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床上室温振荡20 min，充分混合土样与水分，使土壤中的微生物细胞能够充分分散，此为10^-1土壤悬液。吸取1 mL 10^-1悬液于9 mL无菌水中，反复吹吸混匀，制成10^-2土壤悬液。以此类推，将悬液逐步稀释至10^-6浓度。

用无菌移液枪吸取50 μL浓度为10^-6-10^-4的土壤悬液，用三角涂布棒均匀涂抹于琼脂表面。每个稀释度重复5次，放入30 ℃恒温箱中培养3 d。

按照公式(1)计算细菌数。

公式(1)

1.6 DNA提取及Illumina MiSeq高通量测序

不同时期的土壤样品分别标记，如山顶土壤样品为SZ (种植前)、SM (苗期)、SF (分蘖期)、SB (拔节期)、SC (成熟期)。其他两块样地以此类推进行标记。

1.6.1 土壤基因组DNA提取: DNA的提取采用Mobio Powersoil DNA soil Isolation Kit土壤DNA试剂盒。

1.6.2 Illumina MiSeq高通量测序: 各样品选取细菌16S rRNA基因序列V3-V4区，DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。细菌16S rRNA基因序列V3-V4扩增引物为336F (5′-GTAC TCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGAC TACNNGGG TATCTAAT-3′)。PCR反应体系如表 1所示。

PCR反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。扩增PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测阳性后，用Illumina MiSeq高通量测序技术平台进行序列测序。

1.7 数据分析

基于MiSeq测序得到的双端序列数据，对测得的fq数据进行过滤处理，过滤质量较低的序列，根据PE测序的overlap关系将成对的序列拼接成一条序列。通过归类操作，以相似性为依据将序列归类成许多小组，对序列进行随机抽样，以构建rarefaction curve分析测序数据量合理性；通过作稀释性曲线，检测样品的测序深度情况。采用RDP Classier算法对OTU代表序列进行比对分析，并在界、门、纲、目、科、属、种水平上注释其群落的物种信息。以Alpha多样性指示细菌群落的丰度和多样性，以Chao1指数估计群落中的OTU数目，用UniFrac进行beta多样性分析以检测群落之间的物种多样性^[19]，以Shannon来估算样品中微生物多样性。采用Microsoft Excel整理数据，采用DPS和SPSS18.0软件进行差异性分析，采用GraphPad Prism绘图。

2 结果和分析 2.1 巨菌草不同时期对砒砂岩地区土壤基本理化性质的影响

2.1.1 土壤含水量变化: 由图 1可知，在三块样地中，农田地和河滩地的含水量先降低再增加，农田地在巨菌草成熟期时土壤含水量达到峰值，是种植前的2.09倍。三块样地在巨菌草分蘖期以后土壤含水量均呈增加的趋势，山顶地的土壤含水量比种植前增加了1.35倍。

2.1.2 土壤有机质含量变化: 如图 2所示，在三块样地中，巨菌草不同生长时期的土壤有机质均高于种植前期。河滩地和山顶地的土壤有机质变化趋势一致：先增加再减少随后又增加。农田地在巨菌草拔节期时有机质含量达到最大值，比种植前增加了3.82倍，河滩地在巨菌草分蘖期时有机质含量达到最大值，比种植前增加了1.98倍；而山顶地则在巨菌草成熟期时有机质含量最大，比种植前提高了36.83%。由此可以看出，巨菌草的种植提高了三块样地土壤的有机质含量。

2.1.3 土壤pH值变化: 由图 3可知，三块样地在巨菌草的不同生长时期其土壤pH均偏碱性，呈微弱变化，山顶地和河滩地土壤pH先增加再降低随后又增加，两块样地在巨菌草苗期时土壤pH最高，而农田地的土壤pH则是先降低再增加，在分蘖期时农田地的pH最低。

2.1.4 土壤可培养细菌数量变化: 细菌在土壤微生物中是量最多的，参与有机质的分解、氨化作用等。由图 4可以看出，三块样地的土壤细菌量在巨菌草生长期均高于种植前期，且差异显著(P < 0.05)，说明土壤细菌的数量与巨菌草的生长有关。

不同样地巨菌草土壤细菌数量的变化：农田地在巨菌草分蘖期时土壤细菌数量最高，比种植前土壤细菌数量高出8倍多，达2.09×10⁷ CFU/g干土。山顶地和河滩样地土壤细菌的变化趋势均是先增加后降低，但山顶地在巨菌草拔节期时土壤数量高于成熟期。

2.2 测序数据统计与测序质量分析

本研究对3块样地5个时期的土样，进行Illumina MiSeq高通量测序，每个样品3个生物学重复，共获得1864170条序列，过滤掉低质量的序列，优化后得到1739089条序列。统计各个样品在不同OTU中的丰度信息，如表 2所示，15个土壤样品共产生36920个OTU，平均测序读长为400-440 bp。

2.3 土壤细菌群落多样性分析

2.3.1 Alpha多样性分析: 如表 3所示，本研究中Coverage指数均超过了90%，说明测序结果可以反映所测样本中细菌的真实情况。对15个样本采用Shannon指数进行分析，在巨菌草的不同生长时期中，河滩地土壤细菌多样性表现为HM > HB > HC > HF > HZ，苗期比种植前提高了75.72%。农田地细菌多样性表现为NB > NM > NZ > NC > NF，拔节期比种植前期高9.29%。山顶地细菌多样性表现为SF > SB > SZ > SM > SC，分蘖期细菌多样性指数最高，比种植前期高5.62%。随着巨菌草的生长，砒砂岩地区样地的土壤细菌多样性均有所上升，且在巨菌草生长时期的前期其土壤细菌多样性均大于种植前，说明种植巨菌草能够增加土壤细菌的多样性。

Chao1指数反映物种丰富度，Chao1值越大，说明细菌总数越多。在巨菌草生长的不同时期，河滩地土壤细菌丰富度表现为HB > HM > HC > HF > HZ，拔节期比种植前高1.35倍。农田地细菌丰富度表现为NB > NF > NM > NC > NZ，但拔节期细菌丰富度比种植前高25.06%。山顶地的细菌丰富度表现为SF > SM > SB > SZ > SC，巨菌草分蘖期的细菌丰富度是最高的，比种植前细菌丰富度高15.49%。在巨菌草的生长期内，土壤细菌丰富度均比种植前要高。农田地的平均Chao1指数2895.1232较其他两块样地高，说明农田地的细菌丰富度较高。

2.3.2 Beta多样性分析: PCA即主成分分析，其结果(图 5)显示，第一成分的差异贡献值是30.52%，第二成分的差异贡献值是18.9%。其中山顶地的样品之间距离较近，说明山顶地种植巨菌草后土壤细菌群落组成变化不大。三块样地样本距离较远，说明不同的样地土壤细菌群落组成有明显差异。农田地的苗期、分蘖期和拔节期样本(NM、NF、NB)距离较近，成熟期(NC)与以上三个时期样品有一定的距离，而种植前(NZ)距离这四个时期的样本均较远，说明巨菌草的种植对土壤细菌群落组成产生了影响。在河滩地中，种植前(HZ)和其他四个时期样品间的距离较远，并且每个时期的样品之间均有一定的距离，说明巨菌草种植前后细菌菌群组成差异大，每个时期的土壤细菌群落组成也有差异。山顶地苗期(SM)、分蘖期(SF)、拔节期(SB)和成熟期(SC)的样品聚集在一起，说明这四个时期的样品OTU组成有相似的地方，种植前(SZ)与它们距离较远，说明SZ的OTU组成与其他时期样品相差较大。总之，PCA分析能够很好地呈现细菌群落在巨菌草不同生长时期时的变化。

2.4 土壤细菌群落组成分析

2.4.1 细菌在门水平上的群落组成: Illumina MiSeq高通量测序获得的数据在97%相似水平上进行分类。从门的分类水平上看，由图 6可知，在3块样地的5个时期中，放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)相对丰度较大，其相对丰度之和在15个土壤样品中均占到细菌总量的60%以上。在所有土壤样品中，优势菌门为放线菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmictes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadees)、酸杆菌门(Acidobacteria)，共占细菌总数量的80%以上，它们的相对丰度分别为18.24%-50.19%、17.9%-46.37%、0.96%-26.97%、0.35%-10.52%、1.59%-9.42%、0.23%-8.22%、0.3%-6.06%。分析各样品中主要的优势菌门发现，种植巨菌草使土壤中细菌群落的组成发生变化，其中，在河滩地中，绿弯菌门、拟杆菌门、芽单孢菌门、酸杆菌门在巨菌草生长期的各个时期均比种植前的相对丰度要高，绿弯菌门、芽单孢菌门相对丰度在拔节期比种植前分别增加了11倍、19.35倍，拟杆菌门相对丰度在分蘖期比种植前增加了2.32倍，酸杆菌门在苗期比种植前增加了14.33倍。在农田地中，变形菌门的相对丰度在拔节期比种植前增加了47.21%。在山顶地中，绿弯菌门的相对丰度在苗期比种植前增加了1.19倍，芽单胞菌门在成熟期时比种植前增加了1.32倍。在种植前期，三块样地样地中均检测到蓝细菌门(Cyanobacteria)，其相对丰度均高于巨菌草生长的任何时期，在河滩地中蓝细菌门的相对丰度最高。

2.4.2 细菌在属水平上的群落组成: 由图 7可知，在属水平上，除河滩地巨菌草种植前(HZ)土样，非培养和未分类细菌在各样品的各个时期占绝对优势，在河滩地土壤样本中，Pseudarthrobacter、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)三类菌属丰度较高，巨菌草种植前(HZ)土壤中Bromustectorum菌属的相对丰度最高，随着巨菌草的生长，其丰度明显降低，并且在HZ中未出现Pseudarthrobacter菌属，种植巨菌草后其丰度有所增加，在成熟期时丰度最大为9.37%。在HZ中，高温单孢菌属(Thermomonospora)的相对丰度是最高的，为11.17%。农田地样本中，Pseudarthrobacter、假单胞菌属(Pseudomonas)、类诺卡氏属(Nocardioides)、红球菌属(Rhodococcus)四类菌属丰度值较大，嗜盐菌属(Halocella)和热微菌属(Tepidimicrobium)其变化趋势是一样的，随着巨菌草的生长不断减少，在分蘖期和拔节期时均未检测到，但在成熟期时相对丰度达到最大，分别为13.98%、5.36%。马赛菌属(Massilia)和Bromustectorum在种植前期时相对丰度最高，随着巨菌草的生长不断减少再增加，成熟期的相对丰度分别比种植前降低了6倍、3.76倍。而根瘤菌属(Rhizobium)在种植前相对丰度最低，种植巨菌草后其丰度有所增加，分蘖期时的相对丰度是种植前的2.26倍。在山顶地土壤样本中，Pseudarthrobacter、Gaiella、Solorubrobacter、嗜热光合细菌(Roseiflexus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)五类菌属的丰度值较大，鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽球菌属(Blastococcus)四类菌属在种植前的相对丰度均是最高的，种植巨菌草后其相对丰度均有所减少。而中生根瘤菌属(Mesorhizobium)的相对丰度随着巨菌草的生长不断增加，在成熟期时达到最大，比种植前提高了7.16倍。对图中土壤样品中主要微生物菌落种属分析发现，未归到任何种属的other占微生物总量的14.86%-25.77%，表明该序列成分较小无法获得其分类学信息，需要采用其他手段来进行鉴定。而未被分类到的属(unidentified)，占微生物总量的12.38%-64.58%，这可能是由于数据库的限制所造成的。

3 讨论和结论 3.1 巨菌草对砒砂岩地区土壤基本理化性质的影响

土壤养分可以用来评价土壤质量，有机质含量的变化对土壤质量的好坏有直接影响^[20]。在三块样地中，土壤有机质在巨菌草生长的各个时期均高于种植前期，表明巨菌草的种植提高了土壤的有机质含量，对土壤肥力和土壤种植情况有积极的改良作用。钱寿福等^[21]的研究结果表明随着菊芋枝条增加而土壤含水量减少，本研究的三块样地土壤含水量在巨菌草生长分蘖期最低，这可能是由于巨菌草分蘖叶片数增加、蒸腾作用增强有关；分蘖期后呈明显上升趋势，在成熟期各样地含水量接近分蘖期的2倍。土壤pH在整个生长期内变化趋势不是特别明显，土壤酸碱度均呈偏碱性，说明巨菌草对土壤pH影响不大，这与闫慧等^[22]的研究结果相似。

3.2 巨菌草对砒砂岩地区土壤细菌群落结构及多样性的影响

本研究通过对16S rRNA基因序列的V3-V4可变区Illumina MiSeq测序分析，检测了砒砂岩地区种植巨菌草后不同样地土壤细菌群落结构和多样性，获得相对全面的细菌群落信息。通过与RDP数据库^[23]中的信息进行比对分析，在门水平上的优势菌群是放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)，放线菌门的相对丰度较高；在属水平上，含量最高的是未分类(unidentified)的细菌，这说明砒砂岩地区样地土壤中蕴含着丰富的微生物资源，还有很多物种是我们现在还未知的，而这些未知的物种为我们探索物种多样性提供了宝贵的资源。

在河滩地种植巨菌草后，土壤中Pseudarthrobacter、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomanas)的相对丰度有所增加。农田地中Pseudarthrobacter、德沃斯氏菌属(Devosia)以及慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的相对丰度比种植前要高。在山顶地中，Gaiella和中生根瘤菌属(Mesorhizobium)的相对丰度比巨菌草种植前要高。研究结果表明，种植巨菌草对砒砂岩地区河滩地、农田地和山顶地的细菌群落在属水平上的影响是不同的，其中在河滩地种植巨菌草后丰度有所增加的类诺卡氏菌属多被应用于环境、污水治理、生物防护领域，能够降解原油，分解代谢甲硫代三嗪除草剂等物质^[24-25]。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomanas)是一种功能菌群，其代谢机制能够耐受贫营养，在自然界中有着极强的生命力并且分布广泛，该菌属的一些菌株还能够降解多环芳烃等高分子有机污染物^[26]，对于环境污染的治理有着广阔的应用前景。而在农田地丰度有所增加的德沃斯氏菌属(Devosia)与西瓜枯萎病的发病率呈显著负相关^[27]，这说明在农田地种植巨菌草对预防西瓜枯萎病有很好的应用前景；具有固碳作用^[28]的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)丰度也有所增加，这表明种植巨菌草可通过增加固碳菌群丰度来促进农田地土壤碳循环。在山顶地丰度增加的已知菌属为中生根瘤菌属(Mesorhizobium)，其可与豆科植物形成具有固氮能力的根瘤^[29]，因此，在山顶地种植巨菌草有利于根瘤的形成，从而促进土壤的氮循环。砒砂岩地区土壤蕴含着丰富的微生物资源，这些功能菌属类群的发现可以为我们科学规划使用不同类型的土壤提供一个新的思路，可以从内蒙古地区分布广泛的砒砂岩种深入挖掘有利用价值的资源。

Illumina MiSeq测序结果通过丰度指数(Chao1指数)和多样性指数(Shannon指数)来反映砒砂岩样地土壤细菌的群落结构多样性，在本研究中巨菌草种植后，土壤细菌多样性和丰富度均增加，其中Chao1指数在巨菌草生长的任何时期均比种植前要高，在河滩地和农田地，巨菌草在拔节期时Chao1指数是最高的，而山顶地则在巨菌草分蘖期时最高，说明该时期土壤中细菌群落是最丰富的。Shannon指数在种植巨菌草后也有所上升，说明巨菌草的种植提高土壤细菌的群落多样性。河滩地的Shannon指数和Chao1指数在三块样地中均是最低的，说明在这三块样地中河滩地土壤细菌多样性和丰富度较低。

综上所述，巨菌草能明显促进砒砂岩地区土壤细菌菌群多样性和丰富度，能有效提高土壤有机质含量，对土壤pH影响较小，生态效益明显，其应用前景广阔，可作为砒砂岩地区土壤生态修复的先锋植物。