废弃钻井泥浆是钻井过程中产生的泥-水-油的混合废弃物，它们与污油、污水共同组成了油田生产三大污染物^[1]。废弃钻井泥浆包括废弃钻井液、废液、钻屑，颗粒小(0.01–0.30 μm)，含水量高(30%–90%)，通常碱性(pH 8–12)，半流体形态^[2]，含有多环芳烃(PAHs)、重金属以及病原菌，在2016年8月1日起施行的《国家危险废物名录》中被列为HW08 (071-002-08) T类(毒性)污染物。石化行业的发展伴随废弃钻井泥浆年产量逐年增加，目前有效的处置技术及工程应用进程缓慢，大量堆置成为潜在的暴露性污染源。随着油田钻井深度的增加和难度加大，添加剂及有毒有害成分更多更复杂，主要有重金属、油类、膨润土、碱性化合物，包括铁铬盐、磺化沥青、磺化栲胶、磺化褐煤，这些废弃钻井泥浆环境危害严重^[3-5]，碱性高(8–12)、盐度大(3%以上)，再加上石油类物质极易造成土壤板结、肥力下降、营养流失，使植物从土壤中吸收水分困难，根部腐烂，作物减产^{[2, 6]}。各种重金属如铬(Cr)、汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)和化学添加剂对动物及植物生长产生影响，甚至富集在动植物体内进而危害人的健康，最终引发多种疾病^[7-8]。一般情况下，小型钻头钻探3000 m油井，产生500–1000 m³钻井废弃泥浆^[8-9]。我国要求农用污泥中石油类含量控制在3000 mg/kg以内，如果达不到环保处理要求将征收高额排污费^[10]。

近年来，世界各国都针对废弃泥浆的无害化处理技术进行了大量研究，包括焚烧法、固化处理、回收利用、填埋、土地耕作、注入安全地层以及生物处理法等^[10-11]。但物理化学方法分别具有成本高、二次污染、场地受限、效率低、引入其他污染源以及工艺繁琐等缺点。生物处理法工艺简单，成本低廉，针对于废弃钻井泥浆中的有机物质包括正构烃、异构烃、不饱和烃、酸类和酯类等化合物，微生物都有明显的乳化、降解效果，但由于其中存在的重金属、盐类、多聚物、化学处理剂对细胞具有毒害和抑制作用，限制了微生物降解石油的活性和细胞自身的生长繁殖速率。生物处理法存在局限，包括菌剂适应性和广谱性差、修复周期长、石油降解率低、泥浆性质波动冲击工艺的稳定性等^[12]，所以从生物法处理工艺的核心——微生物菌剂性能角度出发，研究高活性和高环境耐受能力的功能菌剂，成为一个重要且必要的突破口。

本研究通过构建高效的复合菌群用于乳化降解废弃钻井泥浆中的石油烃类污染物，达到脱除废弃钻井泥浆中的石油烃、水-泥-油分离、分流处理的目的，为油田废弃钻井泥浆的无害化处理提供一种生物强化的新型工艺方案。

1 材料和方法 1.1 样品采集

废弃钻井泥浆取自大港油田“港356-5”井场废弃泥浆池中，搅拌泥浆使其表面及内部混匀后，取样装入无菌取样袋，至实验室于–80 ℃保存。

1.2 理化性质分析

pH值反映样品的酸碱度，其测定方法参照行业标准方法进行^[13]，pH计(Mettler-Toledo，FE20)测定样品pH值。样品做3个平行取平均值。

含水量可以判断样品中固体和水分两种组分的具体比例。准确称取预先振荡混匀的100 g废弃钻井泥浆，置于70 ℃烘箱中，待烘干至恒重时(前后质量差不超过0.01 g)，计算样品含水量。样品做3个平行取平均值。

土壤有机质和盐度含量分析，可以判断微生物基础营养物及有害物质的比例，判断废弃钻井泥浆处理难度。参照行业标准^[14]，测定废弃钻井泥浆中的土壤有机质含量，样品3个平行取平均值。采用水溶浸提后烘干称重的方法测定土壤中盐度。

采用重量法测定样品中总石油烃百分含量^[15]，采用气相色谱-质谱联用仪(Gas Chromatography- Mass Spectrometer，GC-MS)测定废弃钻井泥浆中萃取的石油各组分的比例^[16]。废弃钻井泥浆中石油烃类物质四组分分析方法参照行业标准进行^[17]。样品做3个平行取平均值。

1.3 微生物群落激活与定向驯化

向装有50 mL无机盐培养基[g/L，NaCl 5.0，KNO₃ 3.0，K₂HPO₄ 1.0，NH₄H₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 1.0，MgSO₄ 0.2，pH 7.0]的三角瓶中加入10.0 g废弃钻井泥浆，添加0.025 g酵母提取物，同时添加0.01 mg丙酮酸钠、1.0 μg N-丁酰高丝氨酸内酯(AHL)和1.0 μg环磷酸腺苷(c-AMP)作为信号分子和干扰剂，降低群体感应系统敏感度和种群之间的共代谢抑制作用^[18-19]，于30 ℃、150 r/min摇床中培养5 d以激活本源微生物的活性(设定为第0代活性菌群)。同传统分离方法相比较，本研究的驯化培养基中使用了丙酮酸钠作为抗氧化剂，降低细胞生长过程中分泌的超氧化物对其他细胞的损害作用^[18]。添加N-丁酰高丝氨酸内酯(AHL)作为信号分子，可以促进处于延滞期的革兰氏阳性菌尽快细胞复苏^[19]。添加环磷酸腺苷(cAMP)作为信号分子，促进细胞参与多种烃类降解相关基因的调节表达，以期望提高群落中活性微生物的降解原油活性^[18]。利用加速细胞自身复苏、降低代谢产物对细胞的损害和促进活性基因表达三种方式，提高菌群驯化效率。

取5 mL上述培养液接种于含有45 mL无机盐培养基的三角瓶中，添加1 g大港油田石油和10 g废弃钻井泥浆，置于30 ℃、150 r/min的摇床中培养，每5 d转接1代，连续转接驯化22代，以检测微生物菌群降解乳化原油的活性。

1.4 群落功能稳定性检测

分别测定驯化第0、6、12、16、18、22代的微生物对总石油烃的降解率来监测群落功能的变化。取10 mL驯化体系中培养液接种到含有90 mL无机盐培养基的三角瓶中，添加2% (W/V)原油为唯一碳源，于30 ℃、150 r/min摇床培养5 d，以相同培养方式、摇床培养不添加活性微生物培养液的原油-无机盐体系作为空白对照，验证驯化微生物菌群对原油的降解效率。培养后用正己烷萃取体系中剩余的总石油烃3次，合并有机相挥发干燥，利用重量法测定不同代数的微生物群落对总烃的降解率，以反映群落在驯化过程中降解石油烃功能的稳定性。

1.5 微生物群落结构分析

微生物群落结构分析参照文献并稍有优化^[20]，通过构建16S rRNA基因克隆文库分析废弃钻井泥浆中的第0代微生物群落(本源群落)和驯化第22代的复合菌群结构。样品总DNA的提取参照土壤样品DNA提取试剂盒(Mo Bio Laboratories，Inc.，USA)操作说明。以提取的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F (5′-AGRGTTTGATC MTGGCTCAG-3′)和1387R (5′-GGGCGGWGT GTACAAGGC-3′)扩增，PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环28次；72 ℃ 7 min。PCR产物用1% (W/V)琼脂糖凝胶、100 V电压电泳检测。目的条带的回收参照凝胶回收试剂盒(Axygen Scientific，Inc.，USA)的步骤；感受态制备和阳性克隆筛选参照文献^[21]，挑选出的克隆样品送华大基因公司测序，所得序列NCBI上进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

1.6 污泥脱油效果分析

分别测定驯化后的活性微生物群落的脱油效果。钻井废弃泥浆经过5000 r/min离心10 min除去上清，沉淀在60 ℃条件下烘干至恒重，之后按照10% (W/W)比例同水混合后，按5% (V/V)接种量接种活性微生物菌群，摇床30 ℃、150 r/min培养5 d，利用萃取称重法测定菌群处理效果。

实验采用的样品有2个，一个是上述废弃钻井泥浆，另一个是耕作土。耕作土风干后于烧杯中加少量蒸馏水使之湿润，然后加30%的H₂O₂ 10 mL，搅拌混匀后70–80 ℃水浴加热氧化。不停搅拌土样，待泡沫平息时，继续滴加H₂O₂，直至土色变淡，无反应为止。重复2–3次。过量的H₂O₂被煮沸排出，冷却后倾去上清液，105 ℃烘干除去土壤有机质，之后磨碎，按300 g/kg原油-土壤比例充分搅拌混匀制作原油饱和土壤，之后按照上述培养方式检验活性菌群脱油效率。按照相同的处理过程和培养条件，以不接种微生物菌群的培养体系，分别设置钻井废弃泥浆和饱和原油的耕作土空白对照。

2 结果和讨论 2.1 废弃钻井泥浆基本理化性质

通过对废弃钻井泥浆的基本理化性质分析，发现其主要污染状态为盐碱环境下的石油烃污染，其总石油烃(TPH)含量远远超出500 mg/kg的临界值，达到12403 mg/kg，盐度达到8562 mg/kg，属于高盐高石油烃含量的钻井泥浆，结果如表 1。

分析废弃钻井泥浆中的原油族组分，发现含量最高的芳香烃，达42.01% (W/W，下同)，含量最少的是脂肪烃类18.76%，沥青质和胶质的含量也很高，分别为20.31%和18.92% (图 1)，它们的高含量增加了对微生物的毒性和降解难度^[10]。

通常，原油中组分含量最高的是脂肪烃，与样品中原油组分有所不同，原因在于废弃钻井泥浆长期被堆置在泥浆池中，烷烃类由于其生物可利用性最高优先被本源微生物所降解，导致其含量最低。芳香烃类、胶质沥青质由于其难降解性，在多年的堆置中因脂肪烃类的逐渐消耗导致其组分比例逐渐增大^[22]。胶质沥青质都是非烃物质，流动性差，粘度高，密度大，且易于形成胶质-沥青质胶束进一步提高分子键能，影响可降解性，这也是样品中这类物质含量高的原因。

2.2 废弃钻井泥浆中本源微生物群落结构

废弃钻井泥浆中本源微生物群落(驯化第0天)多样性不高，主要活性成员经过分析发现假单胞菌(Pseudomonas)在废弃钻井泥浆中所占的比例最高，达27.44%；另外，根瘤菌属(Rhizobium)、红细菌属(Rhodobacter)占比例也较高，分别为20.73%和8.54%，这2个种属的细菌在烷烃、芳香烃及相关衍生物的降解研究中也经常被提及；嗜碱还原硫素杆菌(Dethiobacter alkaliphilus)在群落中占比7.93%，这与废弃钻井泥浆中硫素含量较高有着直接的关系，嗜碱还原硫素杆菌在硫酸盐的还原中起着重要作用^[23]。其他成员包括Anaerovorax sp.、Tindallia texcoconensis、脱亚硫酸盐杆菌(Desulfitibacter sp.)、Alkalibacter saccharofermentans、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter sp.)成员比例均在0.10%以下。以上数据表明微生物经过长期进化后已适应废弃钻井泥浆环境，因此，利用本源微生物群落富集驯化提高活性，用于废弃钻井泥浆中的污染物降解是切实可行的。

2.3 群落功能稳定性分析

分别选取第6、12、16、18、22代驯化菌群对原油降解率(5 d)来衡量群落功能稳定性，以不添加菌群组作对照。从第6代至第22代菌群对原油的降解率在60%浮动，稳定在58.2%–64.3%。第0代处理组对原油有微弱降解能力，是因为废弃钻井泥浆中的本源微生物中有部分微生物能利用石油烃，但其数量较少。随着驯化代数增加，活性微生物得以富集，原油降解能力越来越强。空白对照组中所呈现的原油降解率在8.5%–9.2%之间波动，主要是因为在原油萃取过程中，萃取效率不能达到100%而导致的损失。整体上来说，在驯化第6代以后，群落功能基本趋于稳定，在18代以后活性趋于提高，说明功能菌群具有应用于生产的潜在价值(图 2)。

分析驯化第22代活性微生物群落对钻井废弃泥浆中不同组分的降解效率。经5 d处理后，原油综合降解率为61.7%，饱和烃、芳烃、胶质和沥青质降解率分别达到了92.04%、79.50%、10.27%和16.46%，相对于胶质和沥青质来说，饱和烃和芳烃降解效率很高。如前所述，空白对照的降解率为8.9%，其中饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质的降解率分别为13.4%、11.6%、5.5%和4.1% (图 3)，造成这些降解率不为0的主要原因在于萃取过程损失，以及摇床培养过程中的微量挥发等。Reddy等利用驯化的污泥对含油污泥进行处理，10 d后对芳香烃、胶质及沥青质的降解率分别为48.12%、28.69%和26.66%^[24]，与之相比，本研究中活性菌群降解效率更高。但是，微生物在盐碱环境下对芳香烃、胶质及沥青质等重油污染物进行降解的效率会受到严重限制，目前有关这方面的报道中达到本研究的降解效率的研究尚未发现。

为了进一步分析活性菌群针对原油中不同分子量组分的降解差异，按照石油烃中物质的不同碳原子数归纳，分析钻井废弃泥浆原油中不同组分在降解前后的变化过程，发现 < C18的烃类优先被降解，导致长链烃类比例增加，其中C16比例明显降低，从17%降低到10%以下；同时，活性菌群对C11–C15的降解效果较好(图 4)，在脂肪族烃类含量不高、芳烃比例较高的情况下，说明活性群落对芳烃的降解效果好，符合钻井废弃泥浆中高含量芳烃类降解的处理要求。

2.4 传代活性群落结构组成

从结果2.2废弃钻井泥浆中本源微生物群落结构数据中可以看出，本源微生物群落结构主要活性成员单一，生物多样性水平不高，故小库容16S rRNA基因克隆文库即可表征整个复合菌群中微生物的组成情况。经过22代的传代驯化，活性进一步强化，多样性进一步降低，故本节研究传代活性群落结构，16S rRNA基因克隆文库中在转化的平板上共挑取72个白色克隆，检测假阳性克隆及16S片段的插入方向，将剔除假阳性后剩余的55个克隆进行测序分析，结果如表 2所示。

富集得到的菌群，经过连续22代的诱导和驯化，16S rRNA基因克隆文库分析，第22代菌群中假单胞菌、类希瓦氏菌和盐单胞菌数量达92.72%。其中类希瓦氏菌比例最高，达49.09%，其次是假单胞菌(27.26%)和盐单胞菌(16.37%) (图 5)。研究发现，类希瓦氏菌Alishewanella属于典型的能利用多种电子受体的种属，对缺氧环境下的石油烃降解有着先天优势，非常适合于增强废弃钻井泥浆中石油烃的降解^[25]；同样，假单胞菌在降解烷烃及芳香烃的研究中有着非常广泛的应用，一株铜绿假单胞菌312A对蒽、菲等芳香烃的降解能力很强，尤其是对蒽的降解率在48 d后高达71%^[26]，假单胞菌的大量存在与废弃钻井泥浆中高浓度石油烃污染及其中高浓度的芳烃有着密切关系；盐单胞菌在石油烃降解尤其是盐碱环境下的石油烃降解有非常多的报道^[27-28]。但对于这3种菌同时存在于盐碱条件下的石油烃污染环境中，目前仍没有相关报道。因此，构建的菌群在活性、环境耐受能力以及遗传稳定性和应用方面有深入研究的价值。

2.5 活性菌群处理废弃钻井泥浆土及原油饱和土壤

2.5.1 废弃钻井泥浆土处理: 处理前烘干废弃钻井泥浆中土壤含油率12403 mg/kg，经过5 d处理后废弃泥浆土壤含油率42 mg/kg，脱油效率99.67%，含油废弃泥浆处理前后形态同原油饱和土壤处理前后形态类似(图 6)。微生物菌群处理废弃钻井泥浆过程中，原油降解率为68.9%，同结果2.3和图 2的50%–60%原油降解效果类似，且在不断传代驯化过程中活性有所提高。空白对照培养5 d后废弃泥浆土壤含油率12285 mg/kg，基本没有明显脱油和降解活性，也说明了活性微生物菌群的脱油和降解效果明显。

2.5.2 原油饱和土壤处理: 为了分析活性菌群对含油土壤的处理效率，使用原油饱和土壤检验活性菌群的脱油和降解效果。原油饱和土壤起始含油量261000 mg/kg，微生物群落处理5 d后泥土中含油305 mg/kg，脱油率99.88% (表 3，图 6)，同时发现活性菌群乳化土壤原油过程中，对烃类的降解率为32.56% (表 3)，比上述废弃钻井泥浆的降解率低，原因在于原油饱和土壤中的原油含量很高，超过了细胞生长实际碳源量，导致降解效率降低，但实际降解量较钻井废弃泥浆要高。空白对照培养5 d后废弃泥浆土壤含油率257.6 g/kg，同废弃泥浆土壤类似，也没有明显脱油和降解活性，说明本研究中驯化得到的活性微生物菌群的脱油和降解活性很强。

降解后土壤的颜色和原始土样颜色相近，甚至稍浅，说明驯化的活性群落有很好的脱油活性。结合上述结果中对群落结构稳定性和功能稳定性的分析，说明活性菌群结构经过驯化到了稳定期，同时菌群对化学添加剂、盐类和多聚物的抵抗力强，活性稳定，可用于研发后续的工业生产应用。

3 结论

在过去的20年内，废弃钻井泥浆的生物处理和资源化回收利用相关研究也有很多，从不同的活性菌株到功能菌群再到不同功能菌群复配都进行了大量的探索，而目前通过研究投加活性菌群进而乳化脱除钻井废弃泥浆中的石油烃类，达到资源化回收利用的目的成了研究热点。目前普遍采用的固化处理，通过烧砖、铺路等是消化处理污泥的主要途径^[29]，但是仅仅能达到污泥减量化和减毒，并未达到完全的处理达标和排放要求，因设备成本高、工艺复杂、运行成本高等^[30]。目前看来，也很难有一种新型的、颠覆性的技术解决目前的工业处理瓶颈。

本研究针对大港油田高盐碱含油废弃钻井泥浆开展的环境加压和诱导驯化方法，得到一个活性好、遗传稳定性高、环境耐受能力强的功能菌群，在近一年的不断驯化和活性检测过程中，群落结构和活性趋于稳定，对钻井泥浆中的重金属、盐类、多聚物和化学处理剂具有很强的耐受能力，可以进一步研发应用工艺，包括降低处理成本、微生物-植物联合修复以及缩短微生物处理周期，探讨工业应用潜力。由于钻井废弃泥浆的固体组分比重大，研究水液分离，降低含油量，参数达标后固体用于建筑材料、工程回填、公园填土、道路基底等是可行的。