2018, Vol. 58中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 武俊男, 刘昱辛, 周雪, 王天野, 高强, 高云航, 刘淑霞. 2018
- Junnan Wu, Yuxin Liu, Xue Zhou, Tianye Wang, Qiang Gao, Yunhang Gao, Shuxia Liu. 2018
- 基于Illumina MiSeq测序平台分析长期不同施肥处理对黑土真菌群落的影响
- Effects of long-term different fertilization on soil fungal communities in black soil based on the Illumina MiSeq platform
- 微生物学报, 58(9): 1658-1671
- Acta Microbiologica Sinica, 58(9): 1658-1671
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-19
- 修回日期：2018-03-19
- 网络出版日期：2018-04-26
引用本文 |
2. 吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室, 吉林 长春 130118;
3. 吉林农业大学动物科技学院, 吉林 长春 130118
2. Key Laboratory of Soil Resource Sustainable Utilization for Jilin Province Commodity Grain Bases, Changchun 130118, Jilin Province, China;
3. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin Province, China
施肥是农业生产的主要措施之一，早在19世纪，面对全球人口急剧増加的压力，人类对粮食的需求迫切需要肥料。长期施肥将明显改变作物产量、土壤理化性质和微生物活性[1-4]，对土壤质量和可持续利用具有深远影响。目前，国内外已进行了大量的肥料试验，发现施肥对土壤的影响十分复杂，因土壤类型、生态条件和施肥技术等不同而存在差异[5-8]。在单施化肥的土壤中，有机质含量通常降低，养分失调，作物病害加重[9]；相反，有机无机配施则提高土壤有机质和有效养分含量，增加作物产量，改善作物品质[10]。
土壤微生物与种植制度、作物种类、土壤类型、施肥制度、田间水分管理等农业措施的关系密切，施肥是影响其功能多样性关键因素之一，土壤微生物功能多样性易受肥料的种类、施用时期和用量等影响。真菌是土壤微生物的重要组成, 直接影响土壤有机质循环、养分转化、毒物降解和作物病害发生等[11-13]，是土壤肥力和健康的重要指标之一[14]。研究表明，秸秆还田和施用EM菌(Effective Microorganisms)堆肥提高土壤真菌的Shannon-Winner多样性指数，大量施用化肥则相反[15]。在种植烤烟的土壤中，真菌种类优势菌群包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和未知类型的真菌；单施化肥提高担子菌门、接合菌门和壶菌门等真菌的丰富度；在有机无机配施的土壤中，子囊菌的增幅显著高于单施化肥，说明施用化肥改变了土壤生态环境，有益于真菌生长繁殖，使真菌种群增加，密度增大，优势种群突出，导致土壤真菌化[9]。在研究方法上，由于土壤中真菌数量庞大，种类繁多，且存在大量无法培养的真菌类群，采用传统的培养方法，无法全面了解土壤真菌信息。高通量测序技术针对真菌DNA的保守性，通过先提取、扩增、纯化、定量和均一化真菌DNA序列，再经测序、过滤、优化、聚类，对比基因库中的已知序列，从而鉴别真菌种(属)类，是传统培养方法所获得微生物数量的数十倍甚至数百倍，能准确灵敏地检测土壤真菌[16]。
目前国内外对长期施肥条件下真菌群落结构的研究集中于水稻土中[17]，然而对东北黑土研究较少，因此本文利用ITS rDNA高通量测序技术，研究长期不同施肥对东北黑土养分和真菌种群结构的影响，旨在了解其演变规律，为高产优质及构建良好的土壤生态环境提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 试验区概况试验地点位于吉林农业大学长期定位试验田(43°47'42" N, 123°20'45" E)。试验始于1984年。试验地地势平坦，年平均降水量为549.6 mm，蒸发量为1390 mm，平均相对湿度为65%，≥10 ℃积温2850 ℃，年平均气温为4.9 ℃，平均最高气温28.3 ℃，最低气温–22.4 ℃，无霜145 d，早霜一般在9月末。试验采用微区设计，每个小区用水泥槽隔开，微区面积为2 m2，槽内土层厚度×槽高为150 cm × 170 cm，土壤类型为草甸黑土，供试作物为玉米。
1.2 试验设计试验共设置14个处理：(1)不施肥的处理(CK)；(2)单施低量玉米秸秆(S0.25)；(3)单施高量玉米秸秆(S0.5)；(4)施用氮磷钾肥料(NPK)；(5)氮磷钾配施低量玉米秸秆(NPK+S0.25)；(6)氮磷钾配施高量玉米秸秆(NPK+S0.5)；(7)单施氮肥(N)；(8)氮磷肥配施(NP)；(9)氮钾肥配施(NK)；(10)磷钾肥配施(PK)；(11)单施磷肥(P)；(12)单施钾肥(K)；(13)磷钾肥配施低量玉米秸秆(PK+S0.25)；(14)磷钾肥配施高量玉米秸秆(PK+S0.5)。田间试验采用完全随机区组设计，每个处理3次重复，共42个微区。施肥量N-150、P2O5-75、K2O-75 kg/hm2 (详细见表 1)。施肥方式：P、K肥和玉米秸秆作为底肥一次性施入，N肥的1/3为底肥，其余2/3作为追肥施入。土壤样品采自2015年，土壤的基本理化性状见表 2。
| Treatment | N/(kg/hm2) Base fertilizer aftermanuring |
P2O5/ (kg/hm2) |
K2O/ (kg/hm2) |
Corn straw/ (kg/m2) |
|
| CK | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| N | 50 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| P | 0 | 0 | 75 | 0 | 0 |
| K | 0 | 0 | 0 | 75 | 0 |
| NK | 50 | 100 | 0 | 75 | 0 |
| PK | 0 | 0 | 75 | 75 | 0 |
| NP | 50 | 100 | 75 | 0 | 0 |
| NPK | 50 | 100 | 75 | 75 | 0 |
| S0.25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.25 |
| S0.50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.50 |
| NPK+S0.25 | 50 | 100 | 75 | 75 | 0.25 |
| NPK+S0.50 | 50 | 100 | 75 | 75 | 0.50 |
| PK+S0.25 | 0 | 0 | 75 | 75 | 0.25 |
| PK+S0.50 | 0 | 0 | 75 | 75 | 0.50 |
| Nitrogen is urea (46%), phosphate is superphosphate (14%) and potassium is potassium sulfate (52%). | |||||
| Treatment | pH | MC/% | SOM/% | A-P/(mg/kg) | A-K/(mg/kg) | NH4+-N/(mg/kg) | NO3-N/(mg/kg) | T-N/(g/kg) |
| CK | 7.20±0.25ab | 25.66±0.34bc | 29.21±6.64ab | 21.57±2.66d | 211.36±4.50cdef | 1.78±0.27ab | 0.74±0.12abc | 1.40±0.09ab |
| S0.25 | 7.28±0.19ab | 27.70±1.01a | 27.47±7.23b | 37.35±3.53d | 202.36±4.37defg | 2.02±1.23ab | 0.92±0.28abc | 1.59±0.37ab |
| S0.50 | 7.44±0.21a | 21.53±0.83f | 32.08±2.04ab | 32.22±4.20d | 303.33±9.06ab | 2.15±0.06ab | 0.57±0.09d | 1.50±0.09ab |
| NPK | 6.55±0.13def | 24.27±0.12cd | 28.68±6.61ab | 197.65±2.12ab | 187.70±4.24efg | 1.77±1.45ab | 1.56±0.55a | 1.55±0.07ab |
| NPK+S0.25 | 6.30±0.55ef | 23.65±1.56de | 36.44±2.23ab | 189.06±3.85ab | 220.36±3.17cdef | 2.33±0.52ab | 0.80±0.35abc | 1.64±0.16ab |
| NPK+S0.50 | 6.82±0.31bcde | 22.34±0.27ef | 38.06±2.59a | 109.33±7.16bcd | 249.68±3.07bcde | 2.05±0.46ab | 0.60±0.25cd | 1.66±0.30ab |
| N | 6.18±0.27f | 23.46±1.13def | 28.59±9.77ab | 17.69±6.80d | 156.37±2.50fg | 2.46±0.23ab | 1.48±1.36abc | 1.35±0.09b |
| NP | 6.61±0.28cdef | 24.43±1.08cd | 32.14±2.61ab | 198.20±2.16ab | 141.71±1.53g | 1.82±0.05ab | 0.78±0.06abc | 1.30±0.31b |
| NK | 6.56±0.50def | 23.16±1.22def | 31.55±3.07ab | 42.60±2.61cd | 243.35±4.24bcde | 2.10±0.21ab | 0.64±0.11bcd | 1.41±0.02ab |
| PK | 7.11±0.12abc | 25.82±0.66abc | 30.93±6.60ab | 168.57±5.12abc | 273.67±1.52abc | 1.48±0.58b | 1.14±0.33abcd | 1.64±0.40ab |
| P | 7.14±0.25ab | 26.49±1.48ab | 26.44±5.15b | 181.86±8.01ab | 207.36±2.53def | 2.59±0.67ab | 1.46±0.41abc | 1.46±0.03ab |
| K | 7.04±0.02abcd | 25.43±1.61abc | 32.20±2.74ab | 19.62±4.58d | 289.34±2.10ab | 1.84±0.77ab | 1.00±0.21abc | 1.49±0.05ab |
| PK+S0.25 | 7.18±0.19ab | 26.66±1.40ab | 33.24±7.04ab | 153.35±6.12abcd | 257.27±2.19bcd | 3.09±0.55a | 1.52±0.25ab | 1.87±0.37a |
| PK+S0.50 | 7.27±0.36ab | 21.94±0.51f | 30.35±2.29ab | 265.20±2.12a | 325.70±3.81a | 1.92±0.35ab | 0.66±0.08bcd | 1.41±0.36ab |
1.3 研究方法 1.3.1 土壤取样: 采集时间2015年10月份玉米成熟期，每个微区随机取3棵植株，运用抖落法采集粘附在玉米根系上的根际土，装入已消毒的自封袋中，放入冰盒中带回实验室，每个小区土样分为两份，一份去除杂质过2 mm筛子，并将同一处理的3次平行混合到一起，–80 ℃保存用于DNA的提取，另一份自然风干，用于基础数据测定。 1.3.2 基础数据的测定方法: 土壤含水量测定采用国家标准LY/T1213-1999森林土壤含水量的测定(烘干法)；pH测定采用酸度计法(土水比1.0:2.5)；土壤全氮的测定采用半微量凯氏定氮法；土壤铵态氮、硝态氮的测定采用0.01 mol/L CaCl2浸提-流动分析仪测定；土壤有效磷的测定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；速效钾的测定采用1 mol/L NH4Ac浸提-原子吸收火焰光度法；有机质测定采用浓硫酸-重铬酸钾消煮-硫酸亚铁滴定法[18-19]。 1.3.3 土壤微生物DNA的提取: 土壤微生物DNA提取采用美国MOBIO公司的Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒提取。称取0.5000 g保存于–80 ℃冰箱中的土壤样品，按试剂盒说明书过程提取总DNA；通过超微量分光光度计(Nanodrop 2000)检测DNA浓度≥20 ng/mL，OD260/280为1.8–2.0，OD260/230为1.8–2.0。提取的DNA在–20 ℃条件下保存，用于后续的测定。 1.3.4 DNA文库的建立及上机测序: 高通量测序文库的构建和基于Illumina MiSeq平台的测序由GENEWIZ公司(苏州)完成。使用Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen，Carlsbad，CA)检测DNA样品的浓度，并使用0.8%琼脂凝胶电泳检测DNA的完整性。以5–50 ng DNA为模板，PCR扩增真菌ITS rDNA上的ITS2可变区。通过PCR向ITS rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)检测文库质量，并且通过Qubit和实时定量PCR (Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)检测文库浓度。DNA文库混合后，按Illumina MiSeq (Illumina，San Diego，CA，USA)仪器使用说明书进行双端测序(PE)，图像分析和碱基识别是通过MiSeq工具中的MiSeq Control Software (MCS)进行的，最后在Illumina basespace云端计算平台进行初始分类分析。 1.4 数据分析
双端测序得到的正反向reads首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于OTU分析，使用VSEARCH (1.9.6)进行序列聚类(序列相似性设为97%)，比对的ITS rDNA参考数据库是UNITE ITS database (https://unite.ut.ee/)。然后用RDP classifier (Ribosomal Database Program)贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU的分析结果，采用对样本序列进行随机抽样的方法，通过分析软件Qiime (1.9.1)计算Shannon、Chao1等α多样性指数。通过(Un)Weighted Unifrac分析比较样本间是否有显著的微生物群落差异，基于(Un)Weighted Unifrac样本间距离矩阵信息进行非度量多维尺度(NMDS)分析展示β多样性。利用Canoco 5.0软件对物种及环境之间进行相关性分析(RDA)。利用Excel 2010、SPSS 19.0进行数据统计与分析。
2 结果和分析 2.1 不同施肥处理对土壤养分及玉米产量的影响不同施肥处理土壤的理化性质如表 2，施用氮肥的处理(NPK，NP，NK，N，NPK+S0.25和NPK+S0.50)土壤的pH (6.18–6.82)明显低于CK (7.20)。与空白处理比较，肥料的施用增加了土壤有机质(SOM)和全氮(T-N)含量，特别是添加玉米秸秆的处理；然而对单施化肥(即N，P，K，NK，NP，NPK，PK和NPK处理)的SOM和TN含量影响不大。有效磷(A-P)和速效钾(A-K)在施肥处理(PK+S0.5)含量最多，分别为265.20 mg/kg、325.70 mg/kg；铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3–-N)含量在PK+S0.25施肥处理下明显增多，其他处理之间差异不明显。
不同施肥处理下玉米产量如图 1，由图可知添加氮肥处理(NPK，NP，NK，N，NPK+S0.25和NPK+S0.5)的玉米产量(9180.7–10878.0 kg/ha)明显高于未添加氮肥(CK，S0.25，S0.50，PK，P，K，PK+S0.25，PK+S0.50)的处理(P < 0.01)，并且在NPK施用的处理下玉米的产量最高为10878.0 kg/ha，在空白处理CK下产量为6111.8 kg/ha，说明施用氮肥明显可以增加玉米产量。
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| 图 1 不同施肥处理玉米产量 Figure 1 The corn yield with different fertilizer treatments. |
从表 3我们可以看出，施用氮肥处理(NPK，NP，NK，N，NPK+S0.25和NPK+S0.50)与未添加氮肥(CK，S0.25，S0.50，PK，P，K，PK+S0.25，PK+S0.50)的处理之间在pH呈极显著正相关(P < 0.01)，与土壤含水量(MC)有显著相关性(P < 0.05)，但与产量之间有极显著负相关性(P < 0.01)。说明施用氮肥对土壤pH和产量有显著影响。
| Treatment | pH | MC | SOM | A-P | A-K | NH4+-N | NO3–-N | T-N | Yield |
| N+/N– | 0.779** | 0.370* | –0.212 | –0.088 | 0.494** | 0.080 | 0.023 | 0.205 | –0.937** |
| N+: Nitrogen fertilizer application; N–: No nitrogen fertilizer application. Values indicate correlation coefficient, “–” indicates negative correlation, * indicates significant (P < 0.05). ** indicates extremely significant correlation (P < 0.01). | |||||||||
2.2 不同施肥处理下真菌群落组成
在测序数据初步统计后，从14个样品中获得总共1930282个真菌数列，依据97%的相似度划分为678482个真菌OTU序列。经分析共检测出5个已知真菌门，109个已知真菌属。随机抽取测序样品中的有效序列，以样品中的有效序列(Sequences Per Sample)为横坐标，以OTU数目(Observed OTU)为纵坐标，获得稀释曲线如图 2，通过稀释曲线不仅可以判断样品量是否充分，还可以在样品量充分前提下，对物种丰富度进行预测，结果表明，抽样reads在10000以下时，OTUs数随着reads提高而迅速增加，在10000–20000之间缓慢增加，超过20000之后趋于平缓，说明测序量达到饱和，真菌数以CK处理最多，NPK+S0.50最少。
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| 图 2 土壤真菌的稀释曲线 Figure 2 The dilution curve of soil fungi. |
不同施肥条件下，土壤真菌的群落门水平组成如图 3，由图可知丰度最高的真菌门是子囊菌门(Ascomycota)，占总序列平均值的57.0%，其次为担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和壶菌门(Chytridiomycota)，分别占总序列平均值的18.0%、3.8%、1.1%和0.9%，未被分类到已知真菌(Unclassified)的序列也占有较高比例(19.2%)。从图中我们可以看出在施用玉米秸秆的处理中子囊菌门明显高于无机肥的处理，然而单施钾肥(K)的土壤中担子菌门最高为54.3%。
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| 图 3 不同施肥处理土壤真菌门水平物种丰富度 Figure 3 The composition and relative abundance of fungi communities at phyla-level in different fertilization treatments. |
根据OTU的丰度数据，热图可在属水平上将不同丰度的OTU分块聚类，并根据颜色梯度反映不同样品的物种群落相似性、差异性及物种聚类关系展示样本关系。在样品中共检测出109个已知真菌属，本研究选择不同施肥处理的丰度高的前30个真菌属，利用R语言绘制热图(图 4)，由图所知，上侧为OTU聚类树，右侧为样本聚类树；Unclassified (未知)的真菌属系占大多数，Humicola、Fusarium、Verticillium、Mortierella这4个菌属为优势菌属，并且同属相同的分支聚类。Chaetomium、Trichocladium、Podospora、Preussia 4个菌属在PK+S0.25、PK+S0.50、NPK+S0.25、NPK+S0.50丰度较高，并同属一个分支聚类。其余多数真菌属在不同样品中的丰度具有相似性。
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| 图 4 不同施肥处理土壤真菌群落属水平物种分布热图 Figure 4 The Heatmap of relative abundance about soil fungi communities at genus-level in different fertilization treatments. |
2.3 不同施肥处理土壤真菌多样性分析
Alpha(α)多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，多样性指数是反映丰富度和均匀度的综合指标。其中，群落丰富度指数包括Chao1指数和ACE指数，Chao1或ACE指数越大，说明群落丰富度越高；Shannon指数是用来估算样品中微生物多样性指数之一，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。Goods-coverage指数是各样本文库的覆盖率，数值越高，表明样品中没有被测出的概率越低。不同施肥处理样本群落丰度及群落多样性指数如表 4，由表可知在单施K肥处理下，ACE指数和Chao1指数为最低，说明此施肥处理下多样性指数最低，说明群落多样性最低。Shannon指数也在单施K肥处理下最低，多样性指数最低，说明此施肥处理下物种丰度最低。
| Treatment | ACE | Chao1 | Shannon | Goods-coverage |
| CK | 474.161 | 476.500 | 6.124 | 0.999 |
| S0.25 | 472.220 | 476.553 | 5.902 | 0.999 |
| S0.5 | 436.909 | 438.447 | 5.547 | 0.999 |
| PK | 438.979 | 442.906 | 5.772 | 0.999 |
| P | 441.446 | 448.364 | 5.731 | 0.999 |
| K | 411.185 | 416.263 | 3.877 | 0.999 |
| PK+S0.25 | 487.142 | 498.026 | 5.776 | 0.999 |
| PK+S0.50 | 444.073 | 447.763 | 5.887 | 0.999 |
| NPK | 463.276 | 466.875 | 5.892 | 0.999 |
| NPK+S0.25 | 447.707 | 443.125 | 5.060 | 0.999 |
| NPK+S0.50 | 444.630 | 446.023 | 5.428 | 0.998 |
| N | 434.211 | 437.286 | 5.726 | 0.999 |
| NP | 459.003 | 461.718 | 5.650 | 0.999 |
| NK | 437.222 | 437.784 | 5.891 | 0.999 |
Beta (β)多样性值为2个样本间的相异系数，反映不同样本间的多样性差异，利用各样本间的进化个丰度信息计算样本间的距离，反映样本间是否有显著的微生物群落差异。绘制Unweighted UniFrac距离矩阵热图如图 5，根据距离矩阵Heatmap分析可知，单施钾肥(K)处理与其他处理之间颜色较深相异系数较大，说明土壤真菌群落结构与其他处理间差异较大。如图 5所示NPK+S0.25与NPK+S0.50之间颜色较浅，两者相异系数较小；N、NP、NK 3个处理之间，表示4个样本之间群落差异较小。PK+S0.25、PK+S0.50、S0.50和S0.25四个样本之间相异程度也较小。而施用氮肥与未施用氮肥处理间差异较大，说明施用氮肥导致了真菌群落间存在较大的差异。
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| 图 5 基于β-diversity分析不同处理真菌群落结构 Figure 5 Pairwise comparison of β-diversity with all samples and annotations. Clustering and heatmap were computed using the weighted Unifrac scores. |
2.4 环境因子对不同施肥处理土壤真菌群落结构的影响
为了分析不同施肥处理间土壤理化因子对真菌群落格局的影响，本研究进行典型对应分析，结果如图 6所示。如图所知，环境因子全钾(T-K)、全磷(T-P)、速效磷(A-P)、速效钾(A-K)矢量箭头之间夹角为锐角，表明这4种理化因子之间可能具有协同效应。样品S0.25、S0.50、PK+S0.25和PK+S0.05同铵态氮(NH4+-N)和全氮(T-N)及pH相关性较高，NPK+S0.25和NPK+S0.50同有机质(SOM)相关性较高；菌属Verticillium、Podospora、Preussia和Trichocladium同S0.25、S0.50、PK+S0.25和PK+S0.50这4个施肥处理间的相关性最高；菌属Chaetomium同施肥处理NPK+S0.25和NPK+S0.50的相关性最高。
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| 图 6 真菌属水平物种与环境因子之间的RDA分析 Figure 6 Redundancy analysis (RDA) of fungi abundant genus and environmental variables for soil samples. Environmental factors are generally indicated by arrows. The length of arrow connection represents the degree of correlation between an environmental factor and community distribution and species distribution. The longer the connection, the greater the correlation and the smaller the other. |
3 讨论
本研究结果表明，经过长期秸秆与化肥配施，土壤理化性质有一定的变化。此结果与以前研究相似[20-21]，肥料的施用增加了土壤总有机质和总氮浓度，特别是添加秸秆的处理。与空白(CK)处理比较，不同施肥皆可以增加土壤总有机质和总氮浓度。这些试验结果，证实了肥料施用会改变土壤理化性质[22-23]。土壤经过长期施肥耕作，施用氮肥处理(NPK，NP，NK，N，NPK+S0.25，NPK+S0.50)的土壤pH (6.18–6.82)明显低于未施用氮肥的处理(CK，S0.25，S0.50，P，K，PK，PK+S0.25，PK+S0.50)的pH (7.04–7.28)，尤其是以单施氮肥(N)的处理最低为6.18，氮磷钾肥配施高量秸秆(NPK+S0.50)的pH为6.82，说明单施氮肥加重了土壤酸化，秸秆与化肥配施也会使土壤酸化，但是没有单施氮肥明显；在未施用氮肥的处理中，土壤pH在单施高量秸秆(S0.5)的处理中最高为7.44，其次为低量秸秆(S0.25)处理的pH为7.28，相比于空白处理CK分别提高了0.24和0.08，说明单施秸秆不会使土壤酸化，此结果与前人分析结果大致相同[24]。与对照组(CK)处理对比，秸秆与化肥配施处理(NPK+S0.25，NPK+S0.50，PK+S0.25，PK+S0.50)的土壤总有机质(30.35%–38.06%)明显高于CK的29.21%，说明秸秆与化肥配施可以增加土壤有机质含量，特别是NPK+S0.50处理为最高38.06%，增幅为8.85%。秸秆与化肥配施(NPK+S0.25，NPK+S0.50，PK+S0.25，PK+S0.50)的土壤全氮(1.41–1.87 g/kg)高于对照组(CK)处理的1.40 g/kg，然而对单施无机肥的处理没有差异不明显。土壤是有效磷、速效钾、铵硝态氮也是秸秆与化肥配施的处理高于空白及单施无机肥的处理，与林治安、徐祖祥、梁元振等研究结果类似[25-27]。对于不同施肥处理玉米产量的研究，添加氮肥的处理(NPK，NP，NK，N，NPK+S0.25，NPK+S0.50)玉米产量(9180.7–10878.0 kg/ha)明显高于未添加氮肥的(CK，S0.25，S0.50，PK，P，K，PK+S0.25，PK+S0.50)的处理，并且在NPK施用的处理下玉米的产量最高为10878.0 kg/ha，在空白处理CK下产量为6111.8 kg/ha，说明施用氮肥可以明显增加玉米产量。施用肥料的处理玉米产量都高于对照组(CK)表示施肥可以增加玉米产量，此结果与刘志友、唐谷和卢红萍等研究一致[28-30]。根据养分及产量的数据分析，我们得出结论，在东北黑土玉米种植区，秸秆与化肥配施可以增强土壤供肥能力，提高玉米产量。因此，从pH和养分肥力角度看，为了提高玉米产量并且不会严重破坏土壤，提倡秸秆还田很有必要。
土壤环境变化会在一定程度上影响土壤微生物群落结构和多样性[31]。我们运用Illumina高通量测序技术对不同施肥处理下东北黑土真菌群落结构进行了研究，通过土壤真菌稀释曲线可知，当真菌测序量达到饱和后，真菌丰度和均匀度以空白CK处理最多，NPK+S0.50最少。此结果与陈丹梅研究结果类似[17]。根据结果我们可以得出结论，土壤真菌丰度和均匀度在施肥以后会明显减少。
比较不同施肥处理土壤真菌门水平相对丰度可知，土壤真菌优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和壶菌门(Chytridiomycota)，与前人研究一致[9]，在不同施肥处理下，土壤真菌的子囊菌门在秸秆与化肥配施的(NPK+S0.25，NPK+S0.50，PK+S0.25，PK+S0.50)的处理与空白对照(CK)比较，子囊菌门明显增多，在氮磷钾配施高量秸秆(NPK+S0.50)处理下含量最高为70.35%，子囊菌门具有降解土壤中可溶性有机底物的功能[32]，施用有机肥会增加土壤中有机物物质含量，故而增加了土壤中子囊菌门数量。在整体来看子囊菌门占总序列的57%，需要指出的是，子囊菌是自然界中最为丰富的真菌之一，它们比担子菌具有更快的进化速率和更高的物种多样性[33]，但大多数子囊菌的生物学功能尚不明确, 故很有必要进一步研究它们在土壤肥力、生产力和作物病害发生中的重要作用。在土壤真菌属水平的物种丰度分析中，共检测出109个已知真菌属，丰度前30热图分析中，Unclassified (未知)的真菌属在各个施肥处理中均占较大比例，表明真菌属水平物种分类在现有的分析方法中还需进一步研究；Humicola、Fusarium、Verticillium和Mortierella这4个菌属为优势菌属，说明施肥对这4个菌属影响不大。Verticillium菌属在NK、N两个施肥处理中相对丰度较低，说明施用氮肥对Verticillium菌属影响较大；Humicola在NPK+S0.50施肥处理条件下丰度较低，其余多数真菌属在不同样品中的丰度具有相似性。Chaetomium、Trichocladium、Podospora和Preussia 4个菌属在PK+S0.25、PK+S0.50、NPK+S0.25、NPK+S0.50丰度较高，并同属一个分支聚类；说明秸秆配施化肥对Chaetomium、Trichocladium、Podospora和Preussia 4个菌属影响大致相同。
在Alpha(α)多样性分析结果显示，在单施钾肥(K)处理下物种丰度和群落多样性最低，表明长期单施K肥处理会降低土壤真菌的多样性。在Bate(β)多样性分析中，通过Heatmap分析可知，单施钾肥(K)处理的真菌群落结构与其他处理之间存在较大的差异，施用氮肥处理(N、NK、NP、NPK)的样本之间群落差异较小，而与未施用氮肥处理间差异较大，可以说明施用氮肥导致了真菌群落间存在较大差异。土壤微生物群落多样性及组成的变化与作物类型、施肥等因素相关[34]，研究表明，施用氮肥影响了土壤微生物群落的组成。
在RDA分析中，大量研究表明，环境中某些理化因子例如pH、有机质(SOM)和全氮(T-N)等影响微生物群落结构[35-37]。通过土壤理化性质与真菌组成的RDA分析，可以知道土壤理化性质影响土壤真菌群落结构，尤其是土壤的pH、全量氮磷钾(T-N、T-P、T-K)、有效磷钾(A-P、A-K)和铵态氮(NH4+-N)浓度是重要环境因素。影响真菌群落结构的主要理化性质为pH，这可能是和土壤养分物质存在的形式有关系，土壤中养分物质存在形式又与施肥有相关性，施用氮肥影响了土壤的酸碱性，使土壤酸化严重。
4 结论在长期施肥条件下通过分析得出以下结论，施用氮肥降低了土壤pH，使土壤酸化，但可以明显增加玉米产量；秸秆与化肥配施增加土壤养分，特别是有机质和土壤全氮；长期施肥降低了土壤真菌序列的丰度和均匀度，并且在秸秆与化肥配施中序列数最低；在真菌门水平优势菌群中，子囊菌门(Ascomycota)占总序列平均值的57.0%，并且在氮磷钾配施高量秸秆(NPK+S0.50)的土壤中，子囊菌门高达70.35%。在土壤真菌属水平的物种丰度分析中，共检测出109个已知真菌属，Humicola、Fusarium、Verticillium和Mortierella这4个菌属为优势菌属；Chaetomium、Trichocladium、Podospora和Preussia 4个菌属在PK+S0.25、PK+S0.50、NPK+S0.25、NPK+S0.50丰度较高，并同属一个分支聚类。多样性指数分析可知，秸秆与化肥配施可以增加物种丰度和群落多样性；热图分析可知，是否施用氮肥处理间真菌群落组成存在明显差异。RDA分析中，土壤理化性质影响着土壤真菌群落结构，尤其是土壤的pH、全量氮磷钾(T-N、T-P、T-K)、有效磷钾(A-P、A-K)和铵态氮(NH4+-N)浓度是重要环境因素。研究结果表明，施用氮肥虽然增加了产量，但也造成土壤酸化，真菌数量增加，其丰富度和多样性明显降低，而秸秆与化肥配施可以维持土壤健康生态环境和真菌群落多样性。
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