革兰氏阴性菌的细胞膜是由三部分构成——内膜(又被叫做细胞质膜)、外膜、细胞间质。其中细胞内膜为对称的磷脂双分子层，主要由一些相关的膜蛋白构成，且这些内膜蛋白多为疏水的α螺旋结构；细胞间质为一层充实着大量肽聚糖成分的结构；细胞外膜则是由两层高度不对称性的膜组成的革兰氏阴性菌“对外屏障”——其内单层只包含有磷脂成分，但是外单层主要由脂多糖组成并包含一些对外环境有抵抗作用的外膜蛋白，与内膜蛋白不同的是，这些外膜蛋白多为亲水的β折叠结构^[1-2]。所有的细胞都是由其细胞膜来与外界的环境隔离开来，细胞膜的不同结构决定了细胞膜的不同选择能力——能够允许有益分子如营养素等进入细胞，并有效地阻止有害物质，例如抗生素的进入^[3]。正因为革兰氏阴性菌的外膜有内侧面不对称的磷脂成分及外侧面大量的脂多糖分子，才使得其细胞膜具有独特的难渗透性，有效帮助细菌细胞应对外界有害刺激^[4]。对于绝大多数革兰氏阴性菌来说，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)都是其外膜的必需组成部分，在细菌细胞每一次进行分裂的时候，每个细胞都要合成和运输数百万的LPS分子，LPS在细胞内合成后，会通过ATP水解酶MsbA翻转出内膜，再利用ATP运输盒子LptB₂FG从内膜输出，以周质内起桥梁作用的LptAC运输到外膜，最终通过外膜转运子蛋白复合物LptDE选择性地锚定在外膜上^[5]。至今为止LPS的整个运输过程已经能够通过构建模型来进行形象的描述，Lpt (lipopolysaccharide transportation)系统的各个蛋白结构也得以成功解析，但是LPS的运输过程耗能来源、呈递位点、及系统中7个蛋白的相互作用都还未研究透彻，尚处于起步阶段，故本文以最常见的革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)、沙门杆菌(Salmonella)等为例，主要综述脂多糖运输(Lpt)系统的各蛋白组成，从而阐明LPS的整个运输过程，为后续研究LPS运输过程中的盲点奠定基础^[6-8]。

1 脂多糖的结构和功能简介 1.1 脂多糖(LPS)的基本组成

LPS锚定在革兰氏阴性菌的外膜上，保护细菌细胞远离环境中的有害化合物，在过去的很长时间内，对脂多糖运输系统(Lpt系统)知之甚少，但过去十年的积极研究中，LPS运输系统的研究已有了极大的突破^{[1, 9-11]}。LPS通常包含了2–3种结构——Lipid A (帮助脂多糖分子锚定在外膜上)，核心寡糖，及一种多聚O抗原链(图 1)。O抗原链通常由1–6个糖残基重复单位构成，具有很高的可变性，仅在大肠杆菌中就有170多种不同的O抗原链已被报道^[12-13]。但O抗原链并不存在于所有的革兰氏阴性菌中，其在某些革兰氏阴性菌中是缺乏的，如脑膜奈瑟氏菌(Neisseria meningitis)和鲍特菌属(Bordetella)，这种不存在O抗原链的脂多糖有时也被叫做脂寡糖^[14]。与O抗原不同，LPS的Lipid A和核心寡糖是具有LPS的革兰氏阴性菌均会存在的结构，绝大多数Lipid A是由一个葡萄糖胺二糖构成的，其中大肠杆菌的Lipid A在第1和4’位点被磷酸化，在2和2’位点各有一条脂肪酰链，在3和3’位点上各有一条酯链，且在二糖骨干上的2’和3’的主酯链上会再次酯化，连上一条次级脂肪酸链，且Lipid A的这种结构通常在革兰氏阴性菌中是保守的，只会在各脂肪酸链所在的二糖主骨干的位点上会有所差异^{[13, 15]}；LPS的另一固有组分——核心寡糖在结构上分为内外核心寡糖，其中内核心寡糖在同物种间通常是保守的，由3个Kdo (3-deoxy-D- manno-oct-2-ulosonic acid)结构和3个heptose (L-glycero-D-manno-heptose)结构组成^[16]。

1.2 脂多糖的重要功能

一些小分子亲水化合物可经由孔蛋白被动扩散入细胞中，但是一些大分子化合物和疏水分子却会被LPS构成的阻渗层挡在细胞外，其原理主要是LPS通过内部的负电荷和外部的二价阳离子发生补偿作用，与一些酰基链形成密集填充，从而形成一个疏水性化合物几乎不可渗透的网络结构^[17]。尽管LPS的功能重要，但并不是所有革兰氏阴性菌都必需的外膜组分，这些革兰氏阴性菌会合成一些与LPS类似的糖脂类取代物来扮演LPS的角色^[18]。另外也存在有脂多糖和其他糖脂层共同发挥作用的细菌，例如鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)，会在细菌外膜之外额外形成一层很厚的荚膜多糖层，具有与其他革兰氏阴性菌的脂多糖相似的作用。当我们低表达了Lpt系统中的基因之后，成功抑制了脂多糖在外膜上的锚定过程，但该菌依旧能存活并对疏水性药物戊二醛和有机溶剂20% SDS仍有一定的抵抗作用，但较之野生株，抵抗作用明显减弱，这暗示在一些具有夹膜多糖的革兰氏阴性菌中，LPS不再作为细菌直接抵御外来入侵的屏障，而由荚膜多糖或其他糖脂类取代物取而代之。

但是一些具有完整结构(含有O抗原)的LPS会对细菌形成一个更强的保护作用，可保护细菌远离补体系统的致死作用，并免于被巨噬细胞吞噬，形成一个有效地抵御噬菌体、细菌素和杀菌剂的屏障^[19]。

除此之外，Lipid A也是细菌的免疫系统中非常重要的信号因子，它能使LPS与宿主的Toll样受体4 (TLR4)与脂质结合蛋白MD2组成的TLR4-MD2异源复合体结合，并激活宿主的炎症反应信号通路^[20-21]。也正因为LPS在炎症反应中作为一种有效的激活剂而存在，所以也被称为内毒素^[22]。

故脂多糖至少具有构成细菌阻渗层、药物耐受性、作为信号因子(固有免疫中的作用)等几个重要功能，且构成脂多糖分子的3个部分——Lipid A、核心寡糖、O抗原链分别发挥了不同的作用，并最终实现脂多糖的多个功能。

2 脂多糖运输(Lpt)系统的蛋白组成与结构 2.1 外膜上蛋白复合物LptD/E

现有研究表明，在存在脂多糖的革兰氏阴性菌中，外膜蛋白LptD会和脂蛋白LptE在外膜上形成一个稳定的蛋白复合体，该复合体是至今报道的最大的一对桶状单体复合物^[23]。对LptD/E的首次报道是在鼠伤寒沙门氏菌中，在之后大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中也相继发现了该化合物，现已报道的LptD和LptE单体蛋白的结构有所不同，但是所有的LptD/E蛋白复合物均有相似的结构^{[1, 24-26]}。

其中LptD是一个锚定在革兰氏阴性菌外膜上一个典型的β桶状蛋白，其结构已在之前的文章中详细描述^[27]。LptE在LptD/E复合物中作为LptD桶状蛋白的“塞子”发挥作用，是同时包含了β折叠和α螺旋两种蛋白结构的一种脂蛋白(由3个α螺旋和5个β折叠构成)，LptE的C端结构域的α3与α2形成一个120°的夹角从而与β4和β5形成连接^[28]。在大肠杆菌中，LptE蛋白的最大直径处约为36 Å (1 Å=10⁻¹ nm)，最小处为30 Å，在大肠杆菌中LptE为一个20 kDa左右的小分子蛋白^{[25, 29]}。

就LptD/E蛋白复合物而言，LptE的整个核心部分(β1-4及α1-2)几乎完全插入LptD的C端桶状域中，但其脂质修饰的N-末端区域很可能紧贴LptD的“桶壁”并直接与外膜接触^[30]。

2.2 胞质内转运协同蛋白LptA/C

LptA/C作为Lpt系统的周质LPS转运蛋白复合体，是连接LptB₂CFG复合物与LptD/E易位子的关键蛋白质，LptA的N端与LptC的C端相连，以完成相互作用^[31]。现有研究表明这两个周质运输蛋白在序列上不具有同源性，但在蛋白结构上却具有高度相似性，并呈现出一种独特的β-卷心蛋糕式构象(β–jellyroll architecture)，并由此2个蛋白结构进一步研究发现，整个Lpt系统存在于周质的蛋白或蛋白部分结构域都存在这样的β-卷心蛋糕式构象^{[6, 32-33]}。

其中LptA蛋白包含了185个氨基酸残基(其中27个残基构成其信号肽部分)，现有研究明确报道的LptA蛋白结构共有2种，分别在大肠杆菌和铜绿单胞菌中得以成功解析，就其蛋白大小而言与LptD的N端基本相同，为23 kDa左右的小分子蛋白^[34-36]。其中对大肠杆菌LptA结构的解析，是LPS运输蛋白中第一个成功解析的结构^[34]。在该报道中，明确指出LptA包含16个反向平行的β折叠，形成上文提到的独特的β-jellyroll结构，且这个结构的核心部分是疏水性的，并与LPS存在UV依赖型的交联作用。

LptC的绝大部分蛋白结构存在于细胞间质中(residues 26–191)，但是由于其存在有跨膜区域(residues 7–25)，所以很多研究习惯称其为内膜蛋白。其在发挥运输功能时，会与LptB₂FG转运子按2:1:1:1的比例结合形成LptB₂CFG复合物^[37]。在结构上，与LptA具有同样的β-jellyroll结构，也同样是由16个反向平行的β折叠构成，当然在同一菌株中也与它的LptA具有近似的蛋白分子量——在大肠杆菌中约为18 kDa^[33]。在Lpt途径中，LptC主要通过其疏水端结构域起到绑定LPS的作用，并利用周围环境中的ATP完成向LptA的单向LPS呈递^[38]。

2.3 内膜上ABC运输蛋白LptB₂FG

Lpt系统中位于内膜上起脂多糖抽出作用的LptB₂FG复合物，是一个134 kDa的大分子LPS ABC转运体，每一个拷贝包含有1个LptF、1个LptG和2个LptB蛋白。现对肺炎克雷伯菌和绿脓假单胞菌的LptB₂FG晶体结构已成功解析^{[28, 39]}。

在这个ABC转运体中，最先解析的结构是NBD结构域(nucleotide-binding domains)——LptB蛋白，由Wang等于2014年在大肠杆菌中成功解析，研究指出该LptB的晶体结构属于空间群C2221，其晶胞大小为a=85.16 Å，b=125.76 Å，c=89.61 Å，且α=β=γ=90°。在蛋白结构上，LptB蛋白包含了10个α螺旋和10个β折叠结构，形成了2个不同的结构域——RecA样结构域和α螺旋结构域^[40]。在这2个结构域的中间形成一个疏水性凹槽，是其与这个ABC转运体的TMD结构域(transmembrane domain)——LptF和LptG的结合位点。

LptF和LptG作为这个ABC转运体的跨膜区，与大多数内膜蛋白一样，是典型的α螺旋结构蛋白，各有6个α螺旋结构，此两蛋白形成1个异二聚体，同样形成1个凹槽，与LptB形成的同二聚体的“V”型凹槽对接相连，共同构成一个完整的ABC转运体。据Dong等报道，在肺炎克雷伯菌中，整个LptB₂FG转运体约宽86 Å，长约128 Å^[39]。

3 脂多糖的运输过程

脂多糖正常运输并正确装配至外膜，需要依赖Lpt系统的7个运输蛋白——LptABCDEFG共同完成，Lpt系统的细胞内膜上蛋白复合物共同形成ABC转运体复合物(ATP-binding cassette transporter Complex)，接收由MsbA翻转酶翻转出内膜的完整脂多糖结构。LPS翻转出内膜后，首先被呈递给这个ABC转运体的NBDs (nucleotide binding domains，核苷酸结合区)——LptB，该蛋白在结构上呈完全折叠构型，具有NBDs蛋白典型的“L”构型，而且包含高度保守的Q-loop (Q回路)，用于提供Mg²⁺和ABC转运蛋白特殊的结合基序，并利用该回路在其暴露的结合面形成一个凹槽^[41]。使其能与其所在的ABC转运体复合物中由LptF、LptG构成的跨膜区TMDs (transmembrane domains)构建一个针对LPS的信号传导通路，并将LPS运输至周质转运蛋白LptA/C，LptC-LptA构成类桥梁结构，将自身表面与LPS的LipidA部分进行暂时的结合，由于LipidA本身携带有大量的负电荷，会对邻近的分子间产生静电排斥力，使得LPS能沿LptA−LptC顺利地进行单向移动，接着LPS会通过LptA与LptD间的水溶性周质结构，被运输至Lpt系统位于外膜的β桶装蛋白LptD的N端，这时LPS会从LptD的β1−β26间约16Å宽的脂多糖出口横插入LptD的内部，在LptD的C端桶状蛋白结构中，由LptD的分子伴侣LptE进行方向调整，使其垂直于外膜，沿着LptD的β1−β26的方向，在外膜带正电的Mg²⁺的帮助下完成在LptD蛋白中的侧向移动过程，最终成功装配到外膜上，下文将进一步对LPS的输出过程进行详述^{[8, 42-43]}。

3.1 脂多糖的生物合成及内膜抽出过程

对LPS的生物合成的研究在近20年来已有了极大的进展，主要由Christian Raetz团队进行了大量集中报道，对其合成位置和机制也因此得以明确^[12-13]。研究结果表明，LPS的lipid A核心寡糖是在细菌内膜的胞质面上合成，O抗原部分则是独立于lipid A和核心寡糖单独进行合成，然后再在内膜的外表面结扎在lipid A-core上^[44]。Georgopoulos等在一次基因筛选的过程中，发现MsbA是其热敏等位基因——htrB的多拷贝抑制剂^[45]。基于这个结果，Georgopoulos等明确了MsbA是属于ABC蛋白家族，且就其功能而言，MsbA是一个转运蛋白，通过接收ATP水解产生的能量，来实现将LPS从内膜的胞质面到周质面的翻转功能。要正确地发挥功能，MsbA必须先形成一个二聚体(每个单体都拥有NBD和TMD两种结构)，然后在通过“闭合”和“开放”两种状态转换来完成LPS的翻转过程，然后顺利地将LPS呈递给Lpt系统^[46]。

LPS经翻转酶MsbA翻转至内膜的细胞周质面后，首先接触Lpt系统的LptB蛋白，研究结果暗示LptB很可能在前期是作为ATP酶而发挥作用——使ATP水解而为LPS的运输供能，在水解过程中，LptB会形成变体与同一个ABC转运体中的LptFG相互作用(图 2)。研究人员也通过其结构的改变，发现了LptB是通过ATP水解偶联的手段从内膜组分中提取LPS，再交付给LptFG，最终进入Lpt系统的细胞间质过程，但LptFG参与的运输过程和与间质直接相互作用的同系统蛋白LptC间的作用机制还尚不明确^{[41, 47]}。

如果没有LptB₂FG蛋白复合物，LPS将会累积到细菌内膜的外侧面小叶(leaflet)上，故LPS运输的第一步就是完成糖脂类的抽取过程，这需要经由Lpt系统在内膜上的复合物提供能量和运输渠道。

3.2 脂多糖的胞质运输及外膜装配过程

首先LPS经过膜内的一系列生化作用进行合成，然后由细胞内膜上的ABC转运体MabA将已完成翻转、合成好的LPS呈递给另一个ABC复合转运体LptB₂FG，这个复合物将LPS从内膜胞质面排出至内膜的细胞间质面，进而通过LptC−LptA的类桥梁结构，并将各自的表面与脂多糖的Lipid A一端接触，由于其本身携带有大量的负电荷，与邻近的分子间具有静电排斥力，所以其能沿LptA−LptC顺利地进行单向移动，但据报道，在少部分革兰氏阴性菌中，Lpt运输系统缺少周质脂多糖运输蛋白LptC，会直接将内膜抽出后的脂多糖直接呈递给LptA，再通过LptA与LptD间氨基端相似的水溶性周质结构，完成脂多糖从LptA到LptD运输过程，但Lpt系统的细胞间质内运输机制到目前为止还尚不清楚^{[6-8, 32]}。当LPS接触到LptD的N端结构后便会从LptD蛋白的β1−β26间约16Å宽的脂多糖出口进入LptD的内部，并在输出至LptD的C端结构时经LptE进行方向的调整，使其垂直于外膜，并沿着LptD的β1−β26进行侧向移动，然后由外膜上带正电的Mg²⁺帮助LPS完成在LptD蛋白中的侧向移动过程，最终成功装配到外膜上(图 2)^[43]。

4 展望

至今为止，文献报道的革兰氏阴性菌的脂多糖运输途径只有一条——Lpt运输系统，现代科学已经可以很好地构建模式图对脂多糖的运输过程进行诠释，并且明确该通路倚赖ATP水解产生的能量作为脂多糖单向运输的主要动力来源。总结至今的研究资料表明脂多糖是由Lipid A、核心寡糖及一种多聚O抗原链共同构成的外膜重要结构，其参与了细菌固有免疫、疏水性药物的耐受等多种功能。而Lpt运输系统共由7个运输蛋白组成，由ATP水解供能，对LPS正确运输装配到外膜上的过程是缺一不可的，我们综述了整个Lpt系统的组分后发现，对这7个——3对蛋白复合物的晶体结构已成功解析，对各蛋白之间的相互作用机制也基本明确，但对内膜上ABC转运体的TMDs区LptFG与间质运输蛋白LptC的现有研究仅能说明其依赖ATP水解供能来完成运输过程，其他相互作用机制(如如何完成LPS的方向旋转等)还尚不明确，这将是后续急需研究的方向，若能明确各相邻组分间的相互作用，可帮助更深入地对Lpt系统的各组分进行一些靶向性的实验和研究。弄清楚LPS运输系统各组分间的相互作用机制，也有助于更清晰地阐述LPS的正确装配和发挥作用的过程，对后续研究细菌的固有免疫、对特定药物的耐受作用等至关重要，也是未来的重要研究方向之一。