水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc)是水稻稻黄单胞菌种下致病变种之一，引起水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak，BLS)，近年来该病发生日趋严重，成为水稻的第四大病害^[1-2]。该病原菌从水稻叶片的气孔或伤口侵入，在薄壁细胞间繁殖与危害，因受叶脉限制产生条斑病症状。随着高产杂交水稻品系的大面积推广，以及生产上无有效的抗条斑病种质资源，使水稻安全生产受到严重的威胁。Xoc能够成功侵染其寄主水稻，主要依靠胞外酶类(extracellular enzymes)、胞外多糖(exoplysaccharides，EPS)、生物膜(biofilm)、鞭毛(flagellum)以及Ⅲ型效应蛋白(type Ⅲ secretion system effectors，T3SEs)等毒性因子^[3]的帮助。

Type IV pili (T4P)是革兰氏阴性菌产生的直径为5–8 nm、长约为20 μm的长纤维复合体，是细菌表面的毛状附属物^[4]。Ralstonia solanacearum、Xylella fastidiosa、Acidovorax citrullih和Pseudomonas species等细菌都能产生T4P。数十个基因参与T4P的合成和调节，大多数被命名为pil/fim基因。革兰氏阴性菌的T4P参与细菌活动，如蹭行运动(twitching motility)、生物膜的形成、宿主表面粘附及定殖、细菌毒性、DNA摄取及蛋白分泌等，这些细菌活动都需要具有ATP酶活性的PilT、PilU等蛋白水解ATP提供能量^[5]。T4P在同源六聚体环PilT蛋白水解ATP作用下收缩以发生颤动运动、吸附以及细胞间信息的传递。PilT属于ATP酶家族的成员，具有核苷酸结合模体，与T4P的合成有关。PilT紧贴细胞内膜上，与T4P相连，是T4P收缩所必需的分子马达。PilT是六聚体ATP酶，通过分解ATP提供给纤毛运动的能量，从而保证纤毛在固体表面上运动，同时PilT还有协助纤毛组装的作用。在Pseudomonas aeruginosa中，静态条件下，pilT突变体相比野生型可以形成更加密集的生物膜，揭示了pilT基因与生物膜形成相关^[6]。在Geobacter sulfurreducens中，PilT具有ATP酶活性，能够为细胞外电子转移提供能量^[7]。研究表明，Ⅳ型菌毛及Twitching motility影响P. aeruginosa的致病性，丧失Twitching motility或Ⅳ型菌毛的突变体致病性丧失或减弱。Twitching motility还参与生物被膜的形成，而形成生物被膜则是难以根治铜绿假单胞菌感染的最主要的根源^[8]。

T4P及其在动物致病菌中的致病性已有很多研究报道^[9]，但T4P在植物病原菌中的作用很少涉及，近几年人们开始关注这些表面附属物与植物细菌病原物毒力的关系。PilT作为形成Ⅳ型菌毛过程中重要的亚基之一，对于揭示Ⅳ型菌毛在Xoc中的作用具有重要意义。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒：:

菌株和质粒的特性见表 1。大肠杆菌(Escherichia coli)于LB培养基中37 ℃培养，Xoc菌株于NA或NB培养基中28 ℃培养。NY培养基用于游动性测定，XOM3培养基用于hrpG基因等的诱导表达^[10]。生长所需抗生素浓度：氨苄青霉素(Ap) 100 μg/mL，卡那霉素(Km) 20 μg/mL，利福平(Rif) 75 μg/mL。

1.1.2 供试植物材料：:

烟草品种为本氏烟，水稻品种为感病品种IR24，本实验室保存，种植于上海交通大学农业与生物学院温室。烟草生长4–6周时用于HR反应测定；水稻生长2–3周时用于水渍症状测定，生长2个月大小时用于病斑长度测定。

1.1.3 主要试剂和仪器：:

Xoc基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购于Axygen公司，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于TransGen公司，实验中所用的限制性内切酶、修饰酶购于TaKaRa公司。冷冻离心机、PCR仪和分光光度计购于Eppendorf公司，凝胶成像系统购于Bio-Rad公司。

1.1.4 引物：:

表 2为本研究中所用的引物，根据GenBank登录的基因序列用Primer 5.0软件设计，引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 pilT基因敲除突变体的构建和分子验证

本实验通过无标记双交换敲除的方法^[11]，以RS105 gDNA为模板，利用表 2中的引物pilT-up-F/R和pilT-down-F/R，扩增目的基因的上下游同源片段，上下游同源片段经BamHI单酶切后连接，连接后的片段经Sma I和Xba I双酶切消化处理后，再连接在经相同酶切处理的pKMS1载体上，将重组质粒转化进入DH5α菌株中，LB+Km平板上挑取单克隆测序。将测序正确的重组质粒通过电转化方式导入RS105感受态细胞中，涂布在含有Km+Rif的NAN (NA中不含有蔗糖)平板上。28 ℃培养3–5 d后得到单交换子，将单交换子接种到NAN液体培养基中培养12 h后，取100 μL涂布到NAS (NA中含有10%蔗糖)平板上，28 ℃培养3–5 d后，挑取单菌落分别于NA+Rif和NA+Km+Rif的平板上生长，能在NA+Rif平板上生长但不能在NA+Km+Rif平板上生长的单菌落，即为敲除突变体，命名为RΔpilT。

获得的突变体经PCR和Southern杂交验证。用pilT-up-F和pilT-down-R为引物，以敲除突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增。pilT敲除突变体产生1200 bp的DNA片段，比野生型小1131 bp。经PCR筛选验证的突变体用Southern杂交验证。将突变体RΔpilT和野生型RS105菌株的基因组DNA用Not I和Sma Ⅰ酶切处理，同时将pilT基因上游700 bp片段标记成地高辛探针，按照Southern杂交的方法进行杂交，探针的标记、杂交和检测过程参照Roche的DIG试剂盒说明书。

1.3 pilT基因功能互补子的构建

利用引物pilT com-F和pilT com-R，以RS105的基因组DNA为模板，PCR扩增得到1131 bp DNA片段，经BamH Ⅰ酶切消化处理后，连接在经相同酶切处理的pUFR034载体上，获得重组质粒pUFR-pilT。经酶切及测序验证后，将该质粒通过电转化的方法导入敲除突变体RΔpilT中，挑取单克隆，经Western杂交^[12]验证正确后，获得功能互补子CRΔpilT。

1.4 水稻上致病性和烟草上过敏反应测定

待测菌株单菌落接种于含有相应抗生素的NB培养基中，28 ℃振荡培养24 h后，取一定比例菌液转接入新鲜的NB培养基中，继续培养12 h后，收集菌体，无菌水洗涤1次，调整菌液浓度为OD₆₀₀=2.0，针刺接种于生长2个月的IR24水稻叶片，15 d后观察病斑扩展情况，并统计病斑长度。同样，调整菌液浓度为OD₆₀₀=0.6，用无针头的注射器注射接种于生长状况良好的IR24水稻幼苗叶片上，3 d后观察叶片上水渍状病斑(water soaking，WS)的产生情况。

将上述菌液调整OD₆₀₀=0.1，同样用无针头的注射器注射接种于生长4–6周的本氏烟叶片上，24 h内观察过敏性反应产生情况。上述实验重复3次，每次处理5片叶。

1.5 细菌游动性检测

按照1.4中的方法准备待测菌株。调整菌液浓度为OD₆₀₀=0.5，用移液器取2 μL待测菌液，接种于含有0.5%葡萄糖的NY半固体培养基上，水平放置，28 ℃培养3–4 d后，观察细菌的游动圈，每个样品设置3个重复，统计细菌游动圈的直径，并计算平均值^[13]。

1.6 细菌生物膜检测

采取两种方法进行细菌生物膜测定实验。取浓度OD₆₀₀=2.0的待测菌株5 mL于试管中，室温静置3 d，用移液枪将试管内的菌液吸出，用等体积的无菌水洗涤试管2次，加入6 mL结晶紫，染色30 min。将结晶紫吸出，用等体积的无菌水洗涤试管3次；于37 ℃将试管烘干，观察试管周围的紫色圈，即为生物膜。每个菌株设置3个重复^[14]。

取浓度OD₆₀₀=0.5的待测菌液200 μL于96孔板中，28 ℃培养12 h，将菌液弃去，无菌水洗1次，加入210 μL 1%的结晶紫，染色15–20 min后弃去结晶紫，无菌水洗2次，加入210 μL无水乙醇溶解后，用酶标仪读取数值。

1.7 Real-time PCR

突变体和野生型菌株单菌落接种于含有相应抗生素的NB培养基中，28 ℃振荡培养24 h后，取一定比例菌液转接入新鲜的NB培养基中，继续培养12 h后，收集菌体，XOM3洗涤沉淀1次后，调整菌液OD₆₀₀=1.0；XOM3诱导培养3 h后，按照TransGen公司总RNA提取试剂盒说明书提取细菌总RNA，经无RNase的DNase I充分消化，去除gDNA的污染，之后反转录成cDNA；用表 2中的引物检测hrpG、rpfG、clp、pilA等基因的表达水平。

2 结果和分析 2.1 水稻条斑病菌pilT基因缺失突变体及功能互补子的构建

为了研究Xoc RS105菌株中pilT基因的功能，本研究利用带有反向筛选标记的自杀载体pKMS1，对pilT基因进行无标记敲除。以RS105的gDNA为模板，通过引物对pilT-up-F/R和pilT-down-F/R，分别扩增出pilT基因上下游同源臂pilT up和pilT down (图 1-A)。将同源臂构建在自杀载体pKMS1上，获得重组质粒pK∆pilT。通过电转化，将重组质粒导入RS105菌株中，经过2次同源臂交换，获得pilT基因敲除突变体RΔpilT。

用pilT-up-F和pilT-down-R对野生型和突变体基因组DNA进行PCR扩增，野生型获得预期2331 bp大小的DNA条带，突变体因缺失1131 bp而得到1200 bp大小的条带(图 1-B)。Southern杂交结果显示：与野生型相比，突变体缺失1个1131 bp的信号(图 1-C)。PCR和Southern杂交结果证实，pilT缺失突变体RΔpilT构建正确。同时，PCR扩增pilT基因全长并构建在pUFR034载体上，导入RΔpilT突变体，进行功能互补，命名为CRΔpilT。CRΔpilT经Western杂交验证正确后进行后面的实验研究(图 1-D)。

2.2 pilT基因是水稻条斑病菌Xoc菌株在寄主水稻上的全毒性所必需的

为了检测R∆pilT突变体在水稻上的毒性，我们分别在水稻幼苗期和成株期进行了毒性测定实验。针刺接种成株期感病水稻品种IR24，2周后观察病斑形成情况。野生型RS105菌株在针刺点上下扩展形成较长的条斑症状；而突变体R∆pilT仅在针刺部位形成条斑症状，并不扩展；功能互补子CR∆pilT与野生型菌株症状相同(图 2-A)。同时将这3个菌株注射接种3周龄的感病水稻品种IR24，3 d后观察水稻叶片上水渍状病斑的形成情况，发现野生型RS105菌株、突变体R∆pilT和功能互补子CR∆pilT在水稻上均有致病性，形成水渍状病斑，但4–5 d后观察发现野生型RS105菌株和功能互补子CR∆pilT能够上下扩展，形成明显的条斑症状，而突变体R∆pilT仅在注射点形成水渍状病斑，不能上下扩展(图 2-C)。这些结果表明，pilT基因缺失并未使Xoc丧失在寄主水稻上的致病性，只是显著削弱了病原菌在水稻上的毒性，pilT基因是Xoc在水稻全毒性上所必需的。非寄主烟草上HR测定结果显示，突变体R∆pilT激发烟草产生HR的能力减弱(图 2-D)。

2.3 pilT基因影响水稻条斑病菌Xoc菌株的游动性

植物病原细菌的游动性能够使病原菌获得更多更好的营养物质，逃避不利的寄主环境，与毒性呈正相关。为了检测pilT突变体对Xoc菌株游动性的影响，本研究检测了野生型RS105菌株、突变体R∆pilT以及功能互补子CR∆pilT的游动性。实验发现，在半固体NY培养基上，与野生型RS105菌株相比，R∆pilT突变体的游动性显著下降，功能互补子CR∆pilT的游动能力部分回补(图 3-A)。菌落扩散后的直径统计显示，突变体的游动性较野生型下降了50%，互补菌株恢复至野生型水平的80% (图 3-B)。该结果说明，pilT基因影响Xoc菌株的游动性。

2.4 pilT基因影响水稻条斑病菌Xoc菌株的生物膜形成

R∆pilT突变体致病性降低的同时，也会对生物膜的形成产生一定的影响，因此本研究检测了pilT缺失突变体生物膜的形成情况。玻璃试管表面的附着生长实验显示，R∆pilT突变体形成的生物膜明显多于野生型RS105以及功能互补子CR∆pilT，其中功能互补子CR∆pilT形成的生物膜略多于野生型RS105菌株(图 4-A)。96孔板方法测定生物膜形成情况的实验中，定量检测了Xoc菌株生物膜的形成，R∆pilT突变体形成的生物膜明显多于野生型RS105以及功能互补子CR∆pilT，功能互补子CR∆pilT部分回补形成的生物膜略多于野生型RS105菌株(图 4-B)。实验结果说明，pilT基因影响Xoc菌株的生物膜形成。

2.5 pilT基因影响Xoc菌株相关基因的表达

为了进一步解析pilT基因突变影响Xoc毒性的分子机理，本研究使用qRT-PCR来检测野生型RS105菌株和突变体R∆pilT中主要毒性相关基因的表达情况。水稻条斑病菌hrpG和hrpX两个基因主要调控hrp基因的表达，决定病原菌在寄主植物上的致病性，而hrcC与三型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)的形成相关，同样影响菌株的毒性。实验结果显示，与野生型菌株RS105相比，hrpG、hrpX和hrcC的表达水平在突变体R∆pilT中显著降低(图 5)。这表明，pilT突变体在寄主水稻上致病性降低与hrpG、hrpX和hrcC的转录表达降低有关。在突变体R∆pilT中，clp、rpfG、pilA和pilC的表达量同样明显低于在野生型菌株RS105中的表达量(图 5)。已有研究指出，Xoc rpfG突变体显著影响DSF信号分子的生物合成水平，改变Xoc细胞的群体形态，生物膜聚集，而pilA和pilC与菌体的游动性有关。以上实验结果表明，pilT基因通过影响水稻条斑病菌Xoc相关基因的表达，从而影响毒性、游动性以及生物膜的合成等相关表型。

3 讨论

本实验中，为了研究Xoc RS105菌株中pilT基因的功能，我们通过无标记敲除方式^[11]构建了pilT基因的缺失突变体RΔpilT。研究发现，与野生型RS105菌株相比，RΔpilT在感病水稻上的致病性显著降低，功能互补子CR∆pilT在水稻上的毒性恢复至野生型水平(图 2)。

研究pilT基因在病原菌致病性中的功能时，我们发现与野生型RS105菌株相比，突变体菌株R∆pilT在半固体NY培养基上的游动能力显著降低，功能互补子CR∆pilT游动能力部分回补(图 3)；R∆pilT形成的生物膜明显多于野生型RS105菌株，功能互补子CR∆pilT部分恢复至野生型水平(图 4)。植物病原细菌的游动性和生物膜的产量都与病原菌的毒性相关，影响其在寄主水稻上的致病性^[15]。qRT-PCR实验发现，pilA和pilC的基因的转录表达水平在突变体R∆pilT中显著降低，PilA是构成T4P的主要亚基，PilT能够为PilA蛋白的组装与拆卸提供能量^[16]。在本研究中，pilT突变体能够继续形成T4P，但该突变体缺乏提供菌毛回缩和游动所需的ATP能量，导致游动性降低。同样，c-di-GMP与病原菌的游动性和生物膜合成相关，当菌体内c-di-GMP含量升高时，细菌的游动性明显减弱，而菌体内c-di-GMP的含量是受rpfG调控的，RpfG可以降解c-di-GMP^[17]。在突变体R∆pilT中，rpfG的表达量明显降低，导致菌体内的c-di-GMP含量升高，细菌游动性降低，群体形态发生改变，突变体形成更加致密的生物膜^[18-19]。这些结果表明，突变体R∆pilT可能通过影响游动性、生物膜形成进而影响病原菌的致病性。

在进一步解析pilT基因影响Xoc菌株毒性的分子机理时，我们利用qRT-PCR检测了野生型RS105菌株和突变体R∆pilT中主要毒性相关基因的表达情况。结果显示，与hrp基因表达调控相关的两个主要调控因子hrpG和hrpX基因的表达量明显降低，并且与T3SS形成相关的hrcC基因表达同样明显降低(图 5)，这3个基因都是水稻条斑病菌全毒性所必需的基因^[20-21]。由此我们推断，pilT基因主要通过影响hrp基因表达导致其在水稻上致病性降低。对于pilT基因如何影响hrp基因的表达以及在T4P形成中的作用机制，有待进一步探讨。