偏肺病毒包括人偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)和禽偏肺病毒(avian metapneumovirus，aMPV)。hMPV主要感染儿童^[1]，亦可感染成年人，尤其老人和肿瘤患者^[2]，hMPV感染后引起呼吸道疾病，严重的引起支气管炎和肺炎^[1-3]。aMPV主要感染鸡和火鸡，引起鸡或火鸡的呼吸道疾病，产蛋下降，给养殖业带来很大危害^[4-5]。G蛋白是偏肺病毒粒子表面的一种糖蛋白(Glycoprotein)，由于早期认为该蛋白与病毒的吸附相关，故称之为吸附蛋白(attachment protein)，也有学者将其译为黏附蛋白。不同病毒吸附蛋白命名有所不同。如禽腮腺炎病毒属的吸附蛋白具有血细胞凝集和唾液酸苷酶活性(hemagglutinin neuraminidase activity)，简称为HN蛋白；麻疹病毒属的吸附蛋白只具有血细胞凝集活性而不具有唾液酸苷酶活性，简称为H蛋白。偏肺病毒属的吸附蛋白既不具有血细胞凝集活性也不具有唾液酸苷酶活性，简称为G蛋白。近几年研究发现偏肺病毒G蛋白与其他副粘病毒的吸附蛋白的生物学功能显著不同，目前国内开展的相关研究较少，本文旨在对该蛋白的最新研究成果和进展加以综述和讨论，以期对我国的相关研究有所借鉴。

1 偏肺病毒分类及结构特征

偏肺病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)，偏肺病毒属(Metapneumovirus)。偏肺病毒属包括hMPV和aMPV。hMPV于2001年在荷兰首次发现，从患有下呼吸道疾病儿童的呼吸道分泌物中分离得来^[6]。根据基因序列和抗原性特征，hMPV分为A和B两个基因型，A和B两个基因型又可进一步分为A1、A2、B1和B2四个亚型^[7-8]。aMPV于20世纪70年代在南非的火鸡中首次发现，后来发现在鸡和鸟类中也广为感染，该病毒现已遍布世界各地，分为A、B、C和D四个基因型，其中C型与hMPV进化关系较近^[9-12]。

偏肺病毒是囊膜病毒，病毒粒子直径约100–500 nm，基因组全长约13–14 kb。基因组包括8个阅读框，共编码9种蛋白，包括位于病毒粒子表面的吸附蛋白G、融合蛋白F和小疏水蛋白SH，位于病毒粒子内侧的基质蛋白M和位于病毒粒子内部的核蛋白N、磷蛋白P和大聚合蛋白L，以及由M2基因(包含2个阅读框)编码的两种小分子蛋白质M2-1和M2-2^[13]。

2 偏肺病毒G蛋白结构特征

偏肺病毒G蛋白氨基酸序列长度差异巨大，同源性也较低。hMPV G蛋白由217–241个氨基酸组成，同型之间的同源性相对较高，最低的也有60%，但A型和B型之间同源性较低，距离较大的同源性不足30%^[14-17]。最近，在日本分离到的A型hMPV G蛋白有基因重复插入现象，即其G基因有180 bp序列在ORF内连续重复出现，最终导致多编码60个氨基酸^[18]。A型aMPV G蛋白由391个氨基酸组成，B型aMPV G蛋白由414个氨基酸组成，D型aMPV G蛋白由389个氨基酸组成^[11]。C型aMPV不同分离株的G蛋白大小差异很大。目前发现的来源于火鸡、鹅和番鸭的C型aMPV较大的G蛋白由585个氨基酸组成，其中火鸡源的C型aMPV还有由435、252或251个氨基酸组成的G蛋白。分离自韩国的野鸡源的C型aMPV G蛋白由264个氨基酸组成^[19-20]。aMPV G蛋白各型之间的同源性极低，仅有5%–10%，在同种病毒之间氨基酸差异性如此之大是非常罕见的。Byung-Whi Kong将C型aMPV分别在TT-1细胞和Vero细胞中进行传代培养，当在Vero细胞连续传代15次时，C型aMPV发生了G基因缺失现象，传代病毒G蛋白由585个氨基酸缺失为仅剩下122 bp的小片段，并且不再转录出任何G基因的mRNA^[21]。

偏肺病毒G蛋白包含大量糖基化位点，成熟的G蛋白被高度糖基化。将hMPV感染LLC-MK2细胞，用G蛋白的抗血清检测病毒感染细胞内G蛋白的表达情况，在感染第8天才能检测到表达。在变性胶条件下可看到40、45、48 kDa三条带，在非变性胶条件下除上述三条带外还可以检测到80–90 kDa的条带。利用质粒表达系统在细胞内表达G蛋白(236个氨基酸)可以得到同样的结果，只是由于在G的末端加了8个His的标签使分子量分别变为了45、50、53 (变性胶)和97 kDa (非变性胶)。进一步的实验表明小分子量的G蛋白是N-糖基化，大分子量的G蛋白是O-糖基化^[22]。在非修饰状态下，G蛋白的理论值是26 kDa。通过真核表达系统表达的C型aMPV G蛋白(252个氨基酸)与上述hMPV结果类似，也是得到了三条较小的条带42、45、58 kDa，以及90–110 kDa的较大条带。生化特性分析亦是小蛋白是N-糖基化，大分子量的条带是O-糖基化^[23]。通过杆状病毒表达系统在SF21细胞中表达的G蛋白与在LLC-MK2细胞中表达的相比偏小，可能是由于在不同细胞内糖基化差异引起的^[24]。

偏肺病毒G蛋白为Ⅱ型跨膜蛋白，在一级结构中，G蛋白主要包括质膜区、跨膜区和胞外区，胞外区又可进一步分为颈部区(stalk)和头部区(head)。偏肺病毒G蛋白大小差异巨大，这种差异主要是胞外区氨基酸序列长度的不同所导致，各种不同大小的G蛋白其质膜区和跨膜区氨基酸所包含的氨基酸个数较为一致。副粘病毒的吸附蛋白单体之间以二硫键的方式结合形成二聚体，2个二聚体间通过共价键形成四聚体的高级结构。目前还没有任何偏肺病毒G蛋白的四级晶体结构被解析。

3 G蛋白在病毒吸附中的作用

囊膜病毒的侵染通常分两步进行，首先是病毒粒子吸附到靶细胞表面，这一步通常是非特异性的、可逆的。病毒粒子吸附到细胞表面之后，病毒表面的糖蛋白介导病毒囊膜与细胞膜之间相互融合，进而将病毒的核酸物质释放到细胞质中以启动病毒基因组的复制和病毒蛋白质的合成，或者病毒粒子与靶细胞接触后病毒粒子通过内吞途径形成内吞小体，病毒粒子再与内吞小体膜相互融合后将病毒核酸释放到细胞质中^[25-26]。偏肺病毒G蛋白在吸附过程中能与细胞表面的葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)结合。研究发现GAG在B2型hMPV吸附过程中发挥着重要作用，用GAG酶去除细胞表面的GAG可显著阻止hMPV和重组G蛋白对细胞的吸附。对G蛋白的定点突变研究表明，第149–155位的“EKKKTRA”和159–166位的“QRRGKGKE”2个带正电荷的富含碱性氨基酸的功能域在与GAG的结合中起着关键作用^[27]。Penelope Adamson等对四种不同亚型的hMPV G蛋白(A1、A2、B1和B2)与GAG的相互作用情况进行了进一步研究，发现A1型hMPV G蛋白也能与GAG相互作用，但A2型和B1型hMPV G蛋白不能与GAG结合。序列分析显示A1、A2和B1型hMPV G蛋白均不含“EKKKTRA”和“QRRGKGKE”这样的功能域，但A1型在同位置区域附近含较多的带正电的碱性氨基酸，并且对A1型hMPV G蛋白的缺失研究发现其与GAG相互作用的位置也正在这一区域^[28]。

在研究hMPV G蛋白与GAG的相互作用时不同基因型之间表现出了巨大差异，但当直接用hMPV粒子与GAG相互作用时不同基因型的hMPV粒子均能吸附GAG^{[27, 29]}；研究表明病毒表面的F蛋白也能直接与GAG作用^[30]，F蛋白在不同基因型之间高度保守^[15]，F蛋白在病毒的吸附过程中起着决定性作用^[31]，所以G蛋白只是发挥辅助吸附作用。

4 G蛋白在细胞融合中的作用

细胞融合是很多囊膜病毒感染靶细胞所引起的一种重要现象，通常由病毒表面的糖蛋白所介导。对于副粘病毒而言，介导细胞融合的是病毒粒子表面的F蛋白和吸附蛋白。这些副粘病毒科成员的糖蛋白在介导细胞融合时都是由F蛋白发生一系列结构变化，由融合前结构变为融合后结构进而将相邻的细胞膜拉近并发生融合^[32]。对于多数副粘病毒而言，上述这一融合过程需要借助吸附蛋白的共同参与才能完成^{[26, 33-34]}。对于偏肺病毒，A型和B型hMPV的F蛋白在细胞内均可单独介导细胞融合，无需G蛋白的参与^[35]。对于aMPV而言，其A、B和C型F蛋白也可在没有G蛋白的参与下介导细胞融合(有关D型aMPV糖蛋白介导的细胞融合特征还未见报道)，有趣的是，我们的研究发现A型和B型aMPV G蛋白可抑制其F蛋白介导的细胞融合^[36]，其机制是什么目前还不清楚。

由上述G蛋白在细胞融合中的作用特征可见，G蛋白在偏肺病毒复制过程中并不起主导作用，或者说是可有可无的蛋白。通过反向遗传学技术拯救出的缺失G基因的hMPV和aMPV重组病毒也表明G基因是非必需的^{[31, 37-38]}。但拯救的缺失G基因的A型aMPV重组病毒在细胞内形成的合胞体大于野生型病毒，这一点与我们在蛋白水平上研究A型aMPV G蛋白对F蛋白介导细胞融合的影响是一致的，说明A型aMPV G蛋白无论在蛋白水平还是重组病毒中均可抑制细胞融合。

副粘病毒科成员均为囊膜病毒，病毒基因组编码6–10种蛋白，其中2–3个蛋白位于病毒粒子表面，负责病毒侵染。侵染过程通常由病毒粒子表面的吸附蛋白和F蛋白共同完成。在介导膜融合过程中，F蛋白发生一系列结构变化，通过结构变化释放能量进而将细胞膜和病毒囊膜拉近并发生融合。对于副粘病毒亚科中各个属的病毒而言，如新城疫病毒、副流感病毒、麻疹病毒和尼帕病毒等的F蛋白介导融合时都需要借助吸附蛋白的参与才能完成^{[26, 34]}。肺病毒属的呼吸道合胞病毒以及偏肺病毒属的hMPV和C型aMPV则与上述副粘病毒不同，这些病毒的F蛋白均可单独介导融合，无需吸附蛋白的参与^{[25, 39]}。而A型和B型aMPV G蛋白对融合有抑制作用。由此我们不难看出一个大致脉络，即由副粘病毒亚科成员到肺病毒亚科成员其吸附蛋白对融合的影响是“必需→不需→抑制”。这是一种非常有趣的生物学现象，这种影响的梯次关系有何生物学意义？这在副粘病毒的整个进化史中有什么意义？这些都有待进一步深入研究。

5 G蛋白与宿主免疫系统的关系

病原体引起宿主发病实际上是病原与宿主共同作用的结果。与野毒株相比，缺失G蛋白的重组hMPV在体内的致病性弱于野毒株。重组病毒能使细胞产生大量的趋化因子和Ⅰ型干扰素，而野生型毒株编码的G蛋白可抑制相关因子的表达进而与G基因缺失株相比表现出较强的毒力。其机制是G蛋白通过与RIG-I相互作用，抑制下游基因的转录和表达，进而抑制宿主的先天免疫反应^[40]。进一步研究发现G蛋白的质膜区通过与RIG-I N端的“CARD”功能域相互作用。G蛋白与RIG-I的相互作用抑制RIG-I和ER-MAM回转到线粒体，进而抑制RIG-I/MAVS通路(RIG-I/MAVS通路是宿主抗病毒反应的重要途径)。对G蛋白的突变研究表明，其质膜区N端第二位的谷氨酸和第三位的缬氨酸在发挥免疫抑制功能中起着关键作用^[41]。

除了免疫抑制，有研究表明偏肺病毒G蛋白在免疫逃避中起着重要作用，在疫苗压力下G蛋白易发生变化^[42-44]，这与G蛋白多变的特性也相吻合，快速变异的特性可以逃避疫苗的捕获。除了自身通过变异逃避抗体捕获之外，G蛋白和F蛋白的结构分析预测显示，F蛋白在胞外区的高度分别为13 nm (融合前结构)和17 nm (融合后结构)，而G蛋白在胞外区的高度为23 nm。在病毒粒子的表面，G蛋白的这种结构就像一把“保护伞”一样保护F蛋白免受抗体捕获从而达到免疫逃避^[45]。

6 G蛋白在疫苗开发中的应用

开发疫苗是病毒学研究的重要目的和内容，利用偏肺病毒G蛋白开发疫苗主要有2个途径。一是直接利用G蛋白开发重组蛋白疫苗，二是在病毒基因组中删除G基因获得致弱的重组病毒，开发弱毒活疫苗。

通常情况下，病毒粒子表面的蛋白都能够作为免疫保护性抗原，然而偏肺病毒的G蛋白作为病毒粒子表面的重要蛋白成分并没有免疫保护作用。在真核细胞中表达A1型hMPV G蛋白的胞外区，表达的重组蛋白免疫棉鼠(cotton rat)能产生高滴度的抗体，该抗体既可识别重组的G蛋白，亦可识别hMPV感染细胞后表达的野生型G蛋白，然而体外的病毒蚀斑中和试验显示该抗体并不能中和感染性的病毒粒子。进一步攻毒试验也表明重组蛋白免疫棉鼠后并不能起到免疫保护作用^[46]。将hMPV G蛋白整合到人副流感病毒1或甲病毒的基因组中，利用这些重组病毒表达的hMPV G蛋白同样没有免疫保护作用^[47-48]，这表明hMPV的G蛋白不具备免疫保护作用。利用重组的新城疫病毒表达aMPV (C型)的G蛋白在火鸡内同样不能很好地保护aMPV野毒株的攻击^[49]。而用同样的重组新城疫病毒共表达aMPV (C型)的G蛋白和F蛋白时能够对aMPV野毒株的攻击起到很好的保护作用^[50]，这说明aMPV的G蛋白同样没有很好的免疫保护作用。

反向遗传学是病毒学研究的强大工具，人们可以应用该技术对病毒基因组进行修饰和改造。目前hMPV和aMPV均已建立了反向遗传系统。将偏肺病毒全基因组中的G基因在cDNA水平上删除，通过反向遗传技术拯救出不含G蛋白的重组病毒仍能在体内外复制。将hMPV剔除G基因后拯救的重组病毒在体外细胞内的复制能力没有显著变化，但在仓鼠呼吸道内的复制能力下降40倍，这种致弱的重组病毒能够刺激仓鼠产生抗体并对野毒的攻击起到很好的保护作用^[37]。该研究小组对重组病毒在非洲绿毛猴内的进一步实验显示，缺失G基因的重组hMPV在呼吸道内的复制能力下降3200倍，并且具有很好的免疫原性和对野毒攻击的保护作用^[51]。然而，将aMPV (A型)剔除G基因后拯救的重组病毒在体外细胞内的复制能力下降，在火鸡内的复制能力下降更为显著，并且在体内产生的抗体水平也较低^[52]，这与缺失G基因的hMPV显著不同。同时，aMPV (A型)疫苗株在SH基因的GE (gene end)序列发生一个碱基突变会影响下游G蛋白的表达，进而使疫苗株失去免疫保护作用^[53]。上述不同研究结果说明A型aMPV G蛋白在病毒的复制和免疫保护中有着不同作用和机制。

由上述研究文献可见，偏肺病毒G蛋白本身虽有免疫原性，但G蛋白并没有免疫保护作用，所以直接利用重组的G蛋白开发疫苗的路径是不可行的。但是，通过反向遗传系统拯救缺失G基因的hMPV重组弱毒疫苗具有很好的前景。

7 未来研究展望

病毒学研究不是目的，只是手段，病毒学研究的最终目标是预防、控制和消灭病毒。偏肺病毒G蛋白的研究也是围绕这一目标开展基础研究和应用研究。

在基础研究方面，人们已经比较清楚偏肺病毒G蛋白多变的一级结构特征和多重的生物学功能。与其他病毒的吸附蛋白相比，偏肺病毒G蛋白生物学特性有着明显差异，即便同属偏肺病毒，不同种的G蛋白其功能也有很大不同。然而，目前人们对引起这种生物学功能差异的背后机制还不清楚。蛋白结构的解析对于解释和阐明蛋白的生物学作用具有重要意义。偏肺病毒G蛋白与其他类别吸附蛋白有着显著差异，那么偏肺病毒G蛋白在结构上与其他副粘病毒科成员的吸附蛋白是不是也有很大的差异，解析偏肺病毒G蛋白的晶体结构将有利于揭示引起这些不同类型吸附蛋白差异的微观基础。由于偏肺病毒的G蛋白不仅同源性低，蛋白分子的大小也有着巨大差异，这种多样性给研究带来了很大困难，只有将这些不同的吸附蛋白结构全部解析才能真正解开谜团。目前还没有任一类型偏肺病毒的G蛋白晶体结构被解析，这是将来研究有待解决的一个重要问题。

在应用研究方面，针对偏肺病毒G蛋白的研究重点是疫苗开发，目前已经在实验室开发出缺失G基因的偏肺病毒弱毒疫苗，并取得了初步进展，但后续的临床试验还有待进一步研究。

总之，偏肺病毒的G蛋白与其他副粘病毒科成员的吸附蛋白相比有着显著差异，在偏肺病毒属内部不同成员之间也存在着巨大差异，人们对这种差异的原因及其多重的生物学功能机制还知之甚少，相关研究还任重道远。