肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC)是一类能够引起人和动物肠道外感染的病原菌，主要包括：尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E. coli，UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated E. coli，NMEC)和禽病原性大肠杆菌(Avian pathogenic E. coli，APEC)^[1]。在ExPEC中，UPEC是引起人和动物(犬、猫)尿道感染的最常见的病原体。

双组份系统(Two-component regulatory systems，TCSs)广泛分布于多种细菌中，能够调控与营养摄取、压力应激、耐药性以及其它信号转导途径相关基因的表达^[2-4]，尤其在致病性方面的作用，正逐渐成为研究的热点。TCSs通常由位于跨膜区的具有感应作用的组氨酸激酶感受元件(Sensor)及其相应的效应元件(Response regulator)两部分组成。感受元件能够识别特定环境信号的改变，并将信号传递给效应元件使其活化，活化的效应元件，可直接结合到靶基因启动子上，从而调控下游基因的转录表达^[5]。RstA/RstB系统是一种典型的双组份系统，由跨膜感受蛋白RstB及其相应的效应蛋白RstA组成。研究表明RstA蛋白可被延伸入细胞质中的RstB末端磷酸化，从而激活RstA的DNA结合结构域，调控相关基因的表达^[6]。国外研究发现，在大肠杆菌中，RstA/RstB涉及细菌对酪洛芬、普立地诺和醋竹桃霉素的抗性作用^[7]；RstA的多重拷贝能够抑制编码ATP酶的yjeE基因缺失株的致死性表型^[8]，表明其能代偿ATP酶合成途径；Ogasawara等还指出大肠杆菌中的RstA可以使asr (酸应激RNA)表达上调^[9]；另有研究发现在沙门菌中，RstA在细菌应对饥饿环境与各种应激过程中发挥着关键作用^[10-11]；此外，RstA对于维持胞内铁离子浓度的平衡也起着重要作用^[12]，因铁离子是细菌生存所必须的元素，因此也有学者认为该系统可能参与病原菌的致病过程，但缺少直接证据证明该推论。

本研究为了探讨TCS RstA/RstB中效应基因rstA与UPEC致病性的关系，利用λ Red重组系统，构建了rstA缺失株UPEC U17ΔrstA，旨在进一步了解TCS在UPEC致病过程中的作用及深入研究UPEC的致病机理。

1 材料和方法 1.1 菌株和质粒

UPEC U17菌株为本实验室由临床尿道感染病例中分离的人源强毒株^[13]，血清型未定。质粒pACYC184由本校朱国强教授惠赠。本研究所用的质粒和菌株见表 1。

1.2 运用λ Red重组系统构建基因缺失株U17ΔrstA

1.2.1 引物的设计: 根据质粒pKD3序列，设计引物AF/AR扩增氯霉素基因，并在引物的5′端分别加50 bp的rstA上下游序列，作为同源重组的同源臂(下划线部分)。引物BF和BR为rstA开放阅读框上下游序列，结合CF和CR进行rstA缺失株的鉴定。引物HF和HR扩增rstA ORF及其启动子在内的序列，用以构建回复株。引物QF和QR用于荧光定量PCR检测rstA基因的表达水平。引物序列见表 2。

1.2.2 重组片段的扩增: 以pKD3为模板，使用引物AF/AR扩增并回收两端带有50 bp rstA同源臂的氯霉素基因的PCR产物，用于λ Red同源重组反应的线性打靶DNA。PCR扩增片段约1.1 kb，PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。经电泳鉴定为预期长度的PCR产物，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收纯化DNA片段。

1.2.3 U17ΔrstA缺失株构建: 将PCR扩增的重组片段电转化到含有pKD46的感受态细胞U17中，通过λ Red重组系统构建基因缺失株U17ΔrstA^[14]。

1.3 回复株的构建

利用在线软件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测rstA基因的启动子。根据预测结果，设计引物HF/R，扩增包括rstA ORF及其启动子在内的序列。将目的片段克隆入回复质粒pACYC184，构建重组质粒pACYC184-P_nativerstA。将重组质粒电转入缺失株中，构建回复株。

1.4 缺失株生物学特性的研究

1.4.1 细菌在LB普通和贫铁培养基中生长曲线的测定: 分别将野生株和缺失株的单个菌落接种于5 mL新鲜LB培养基中，37 ℃、220 r/min摇振培养过夜，第2天吸取培养物加至10 mL的LB普通或含有200 μmol/L铁离子螯合剂2, 2′-dipyridyl (DIP)的LB贫铁培养基中^[15]，调节OD₆₀₀至0.05，37 ℃、220 r/min摇振培养，连续4 h；每0.5 h测定培养物的OD₆₀₀值，然后根据测定的值对细菌的生长曲线进行绘制，分析野生株与缺失株在LB普通和贫铁培养基中的生长差异。

1.4.2 体外环境应激实验：: 细菌三区划线于LB平板上，37 ℃静置培养16–18 h，挑取约10个单菌落在LB固体培养基上满板划线，37 ℃静置培养4 h。用1 mL含15%甘油的PBS将LB平板上的细菌刮下，将细菌浓度调至1×10⁸ CFU/mL。

各取100 μL细菌悬液分别与900 μL pH 4.0的酸性LB培养基、pH 10.0的100 mmol/L Tris碱溶液、10 mmol/L H₂O₂溶液混匀，37 ℃培养箱中静置作用30 min；另各取100 μL细菌悬液分别与3 mol/L尿素溶液、4.8 mol/L NaCl溶液1:1等体积混匀，37 ℃培养箱中静置作用60 min。混合液取出用15%甘油PBS连续倍比稀释，平板计数，18 h后观察结果。

1.4.3 菌株生物被膜检测: 按Srdjan Stepanović等描述的微孔板生物被膜检测方法^[16]进行，挑取单菌落至液体LB培养基过夜振荡培养，取100 μL母液加到10 mL LB液体培养基中，220 r/min，37 ℃振摇培养2 h，调定菌液浓度至OD₆₀₀为0.1，96孔培养板中每孔加入100 μL菌液，放入37 ℃培养箱中静置培养24 h，小心弃去培养液，PBS洗3遍，自然风干，每孔加0.1%结晶紫染液室温染色30 min，PBS洗3遍，风干后加入100 μL乙醇脱色，充分溶解结晶紫后，脱色液用酶标仪测定OD₅₅₀值，重复3次取平均值。

1.5 细菌RNA提取及荧光定量PCR

1.5.1 细菌RNA的提取: 挑取U17菌落至3 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇振培养过夜，按1:100比例分别加至新鲜LB和LB-Fe (200 μmol/L DIP)液体培养基中，37 ℃摇振培养至OD₆₀₀为0.4–0.6，提取细菌RNA，具体操作按照TaKaRa公司的RNAiso Plus Total RNA提取试剂说明书进行，并使用gDNA Eraser (TaKaRa)去除基因组DNA污染，测定A₂₆₀/A₂₈₀分析RNA的浓度。

1.5.2 cDNA的合成: 利用PrimeScript^®RT reagent kit (TaKaRa)进行cDNA的合成。加入组分如下：4 μL 5×PrimeScript^® Buffer，1 μL PrimeScript^® RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，10 μL RNA，加RNase Free dH₂O补足至20 μL，混匀。进行反转录反应，程序为37 ℃ 10 min，85 ℃ 5 s。

1.5.3 荧光定量PCR: 利用软件设计rstA荧光定量PCR的引物QF/R (表 2)。以管家基因gapA为内参，利用荧光定量PCR检测rstA基因在贫铁环境中的相对表达水平。荧光定量PCR的反应体系参照SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)进行，20 μL反应体系中加入2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加灭菌超纯水至20 μL。混匀后在ABI 7500 Real-time PCR扩增仪中进行，反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.6 6周龄BALB/c小鼠尿道感染试验

利用6周龄BALB/c小鼠尿道感染模型^[17]，分别测定野生株、缺失株和回复株对小鼠的致病性。在小鼠尿道攻毒前24 h，收集尿液并作细菌计数，计数结果在10² CFU/mL以上的予以剔除。在小鼠攻毒之前，轻轻挤压其腹部以尽可能排净膀胱内尿液，用适量2%戊巴比妥钠(40–70 mg/kg体重)腹腔注射麻醉。按照Model“11”Plus Syringe Pump的使用说明，将其连接内径0.28 mm的塑料导管经尿道接种50 μL菌液(含10⁸ CFU)，操作要谨慎防止人为原因导致输尿管回流。感染后48 h扑杀，取其膀胱、肾脏做细菌计数，扑杀前取尿液做细菌计数，检测细菌经尿道感染48 h后在小鼠体内的动态分布。

2 结果和分析 2.1 U17ΔrstA缺失株的构建及鉴定

将扩增出的带rstA同源臂的氯霉素抗性基因片段rstA-cat电转化入含有pKD46的野生株U17菌株中，诱导同源重组，挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性克隆株进行PCR鉴定，以BF/R引物扩增出带氯霉素抗性基因片段，对照野生株扩增片段为720 bp，突变株条带大小为1100 bp (图 1)，表明缺失株U17ΔrstA构建成功。

2.2 回复株的构建及鉴定

构建回复质粒pACYC184-P_nativerstA后，电转化U17ΔrstA缺失株。PCR鉴定筛选出的拯救回复株，PCR扩增出大小为720 bp左右的rstA野生株条带，说明rstA回复成功并命名为ReU17ΔrstA (图 2)。

2.3 缺失株的生物学特性

2.3.1 U17及缺失株在LB普通培养基中的生长曲线: 根据U17及缺失株在LB中分别培养0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h时的OD₆₀₀测结果，绘制的生长曲线可以看出rstA基因缺失株的生长速度较野生株相比无明显差异(图 3)。

2.3.2 U17及缺失株在LB贫铁培养基中的生长曲线: 将野生株和突变株分别接种于10 mL含有200 μmol/L铁离子螯合剂DIP的LB贫铁培养基中，从生长曲线可以看出，自3 h后，缺失株的生长速度较野生株相比明显下降(^**P < 0.01) (图 4)。

2.4 体外环境应激实验

比较缺失株和野生株在不同的环境压力条件下的存活情况，结果显示缺失株在pH 4.0的酸性LB培养基、100 mmol/L Tris碱、3 mol/L尿素、4.8 mol/L NaCl高渗透压溶液以及10 mmol/L H₂O₂中的存活率与野生株相似(P > 0.05)(图 5)，表明rstA的缺失对于细菌在这几种环境条件下的生存没有影响。

2.5 菌株生物被膜检测

生物被膜检测结果显示，野生株U17 OD₅₅₀值为0.326±0.022，而U17ΔrstA的OD₅₅₀值为0.342±0.018，与野生株相比差异不显著(P > 0.05)，表明rstA基因缺失对UPEC生物被膜形成能力没有影响。

2.6 荧光定量PCR结果

qRT-PCR结果显示，U17在LB贫铁环境下，rstA基因的表达量较在LB正常培养条件下显著上调2.38倍(^**P < 0.01) (图 6)，暗示贫铁环境可能是rstA发挥效应的刺激信号。

2.7 6周龄BALB/c小鼠尿道感染试验

48 h的体内动态分布试验结果显示，与野生株相比，缺失株U17ΔrstA在尿液、膀胱、肾脏中的带菌量明显下降(^*P < 0.05)，表明rstA缺失致毒力显著降低，而回复株毒力恢复接近野生株水平(图 7)。

3 讨论

UPEC在入侵宿主建立尿道感染的过程中，要面对的一个主要宿主环境就是尿液。尿液是一种营养匮乏的环境，其中氨基酸、小分子多肽和核苷酸等含量很低，大量的是尿素成分^[18]。UPEC能够适应尿液环境并在其中生长，主要利用多肽和氨基酸作为碳源^[19]，其生长还依赖于另外一个重要的营养元素—铁离子，但是游离的铁离子在尿液中的含量也是极低的^[20]。UPEC对尿道的感染除了受限于营养代谢，还会面对其它一系列的环境压力，如活性氧、高浓度尿素，pH值，补体和其它的抗菌物质以及与其它微生物的竞争压力等等^[21]，因此处理与这些环境压力的关系对于UPEC能否成功建立感染至关重要。

TCSs在感受环境信号，调控细菌生理代谢以及致病性方面发挥着重要作用。在大肠杆菌中，通过对K-12菌株全基因组序列分析，发现存在29种组氨酸激酶感受元件、32种效应元件和1种组氨酸标签磷酸化转运子^[6]。每种双组份系统在参与细菌环境适应性的过程中，往往能够识别特定的环境信号，换句话说，在某种特定的环境信号的刺激下，往往会激活相应的双组份系统参与应答，增强细菌的适应性。在众多的双组份系统中，已有部分系统被确认参与到UPEC的致病过程中，例如，TCS BarA/UvrY能够有效的控制碳源的糖分解和糖异生途径的转换，促进UPEC的致病作用^[22]；TCS QseC/QseB中，QseC激酶的缺失，能够异常调节核苷酸、氨基酸以及碳的代谢，并直接导致UPEC毒力的下降^[23]；另外，TCSs中PhoQ/PhoP和AirS系统也被认为与UPEC的致病性相关联^[24-25]。目前，关于TCS RstA/RstB的环境刺激信号以及该系统是否参与UPEC的致病进程未见报道。

在TCS RstA/RstB系统中，RstA作为效应蛋白发挥着调控功能，本研究针对rstA效应基因，采用基因突变的方法，构建了rstA的缺失突变株，通过比较缺失株和野生株的生物学特性及致病性，以期了解rstA基因的生物学意义和功能，尤其对致病性方面的影响，进而明确其是否为UPEC的毒力基因。

通过体外模拟体内宿主环境试验，比较了rstA缺失株和野生株在强碱、强酸、高浓度尿素、高渗透压、氧化应激等环境条件下的生存能力，结果显示，缺失株在这些环境压力下的生存能力较野生株相比无明显差异，表明rstA可能对于UPEC应对上述几种环境压力过程中发挥的作用有限。但在贫铁环境中，rstA缺失株的生长速度较野生株相比明显下降，另外，qRT-PCR结果也显示，在贫铁条件下，rstA基因的表达量较正常条件下明显上调，这些结果提示，贫铁环境可能是rstA发挥效应的一种刺激信号。

此外，缺失株与野生株相比，在6周龄BALB/c小鼠尿道定殖能力显著下降，主要表现在尿液、膀胱和肾脏中的带菌量明显降低，表明rstA缺失导致UPEC U17的毒力下降，另外通过对缺失株中的rstA基因进行回复，显示回复株在尿道中的定殖能力接近野生株水平，说明缺失株致病力的下降主要是由于rstA缺失所致，进而说明rstA效应基因与UPEC的致病力相关联，由此可见TCS RstA/RstB在尿道致病性大肠杆菌的致病过程中发挥一定的作用。