多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种革兰氏阴性短杆菌，临床上能引起包括牛、羊、猪等在内的多种动物发病。根据其荚膜抗原差异，多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F等5种血清型^[1]。关于多杀性巴氏杆菌的致病性以及毒力因子的研究报道较多，目前已被鉴定出的毒力因子包括黏附素(ptfA等)、铁摄取调节蛋白(exbB等)、胞外蛋白酶(nanB等)、脂多糖及外膜蛋白等^[2]。

多杀性巴氏杆菌是一种能引起牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的细菌性病原^[3]。牛呼吸道综合征(BRDC)，俗称“运输热”，是由于应激作用等因素引起牛出现肺炎、支气管炎等疾病的统称^[4]。此外，研究还发现多杀性巴氏杆菌能与牛类支原体生物(Mycoplasma-like organisms)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza type 3 virus)等牛呼吸道综合征其他相关病原发生混合感染^[5]。因此，由多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道综合征对于我国乃至全球养牛业发展都造成了巨大的经济损失。本研究采集2017年8月至2018年4月份疑似患有呼吸道综合征的犊牛病料，分离疑似多杀性巴氏杆菌的临床菌株，通过血清型PCR鉴定方法和绘制16S rRNA的系统进化树对细菌进行分析，并检测了7类共23种毒力基因在牛源多杀性巴氏杆菌中的分布情况。

1 材料和方法 1.1 主要仪器和试剂

PCR仪购自日本TaKaRa公司；Green Taq Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Trans 2K DNA Marker及Trans 2K Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司；无支原体新生牛血清购自浙江天杭生物技术股份有限公司。血琼脂平板以及THB液体培养基均为实验室配制。

1.2 多杀性巴氏杆菌的分离

1.2.1 样品来源:

2017年8月至2018年5月采集持续性发热并伴有呼吸道炎症的6–8月龄犊牛鼻拭子327份。

1.2.2 细菌分离:

往鼻拭子样品采集管中加入300–500 μL高压过的PBS充分混匀。用灼烧过的接种环蘸取样品上清液，涂布于血平板上，置于37 ℃温箱中培养12–24 h后进行肉眼观察，挑取单菌落接种于含10%犊牛血清的THB液体培养基中，置于180 r/min、37 ℃中进行纯培养。

1.3 多杀性巴氏杆菌的鉴定

1.3.1 引物的设计与合成:

根据文献报道^[6]，合成用于检测牛源多杀性巴氏杆菌的特异性引物(表 1)。所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR体系及程序:

PCR反应在20 μL体系中进行：Green Taq Mix 10 μL，ddH₂O 6 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL。反应程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 35个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统扫描照相。

1.4 多杀性巴氏杆菌的血清分型及16S rRNA基因的扩增测通

1.4.1 引物的合成与设计:

根据文献报道^[6]，合成用于鉴定多杀性巴氏杆菌血清型的引物(表 2)。利用通用引物对多杀性巴氏杆菌的16S rRNA基因进行扩增(表 2)。所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4.2 PCR体系及程序:

血清型鉴定PCR反应在20 μL体系中进行：Green Taq Mix 10 μL，ddH₂O 6 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL。反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。16S rRNA PCR反应在40 μL体系中进行：Green Taq Mix 20 μL，ddH₂O 14 μL，上游及下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL。反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，鉴定血清型的PCR产物利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统扫描照相。16S rRNA PCR产物则送往金斯瑞生物科技有限公司进行双向测通，并进行拼接。

1.4.3 16S rRNA全基因序列的系统进化树分析:

利用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0对已完成测序的多杀性巴氏杆菌16S rRNA全基因序列进行遗传进化分析，并同时从GenBank下载已完成测序的多杀性巴氏杆菌16S rRNA全基因序列一并进行分析。

1.5 多杀性巴氏杆菌毒力因子的鉴定

1.5.1 引物的设计与合成:

根据已报道的文献[7]合成用于鉴定多杀性巴氏杆菌主要毒力因子的引物，所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。主要毒力因子包括：黏附素相关基因(fimA，hsf-1，hsf-2，ptfA，pfhA，tadD)；铁摄取相关基因(exbB，exbD，Fur，hgbA，hgbB，tonB)；外膜蛋白相关基因(oma87，ompA，ompH，plpB)；超氧化物歧化酶相关基因(sodA，sodC，tbpA)；唾液酸激酶相关基因(nanB，nanH)；透明质酸酶相关基因(pmHAS)；毒素相关基因(toxA)。

1.5.2 PCR体系及程序:

PCR反应在20 μL体系中进行：Green Taq Mix 10 μL，ddH₂O 6 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL。反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，Δ ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统扫描照相。

1.5.3 数据统计:

利用Excel卡方检验对多杀性巴氏杆菌的主要毒力因子进行统计分析。

2 结果 2.1 牛源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2017年8月至2018年4月期间对送检的237份临床病料采用绵羊血平板分离培养出疑似多杀性巴氏杆菌菌落，通过PCR反应共鉴定出31株多杀性巴氏杆菌(图 1)，分离率为13.1%。利用PCR方法对所分离出的菌株进行血清型鉴定，共分离出31株A型多杀性巴氏杆菌(图 1)，占比100%。就分离地区而言(表 3)，从山西、内蒙古以及河北的病料中分离出较多株的多杀性巴氏杆菌，这可能与3个地区送检病料总数较多有关。

2.2 牛源多杀性巴氏杆菌的血清分型及亲缘关系分析

利用PCR方法对所分离出的菌株进行血清型鉴定，共分离出31株A型多杀性巴氏杆菌，占比100%。31株菌株来自8个省份，表明牛源A型多杀性巴氏杆菌在我国分布的广泛性。此外，本研究基于16S rRNA全基因序列构建的遗传进化图中(图 2)发现31株A型多杀性巴氏杆菌的亲缘关系极为接近，属于同一亚群，其序列同源性与中国分离株HB01以及国外分离株USDA-ARS- USMARC-60712、USDA-ARS-USMARC-60214、ATCC 43137以及36950亲缘关系较近。值得一提的是，本研究发现来自于内蒙古分离株NMG1708-1、NMG1709-2、NMG1804-1、黑龙江分离株HLJ1708-2、新疆分离株XJ1708-1、山西分离株SX1804-3以及河北分离株HB1709-3共7株分离株被归于同一分支，提示其可能存在有更为相近的遗传进化关系。

2.3 牛源多杀性巴氏杆菌毒力基因的扩增

本研究利用PCR方法共检测了7类共23对毒力基因(图 3)。检测结果显示(图 4)，A型多杀性巴氏杆菌中均携带有大部分的毒力基因，但是不同菌株携带的情况有所差异。其中，黏附素相关基因(fimA，hsf-2，ptfA)、铁摄取相关基因(exbB，exbD，Fur，tonB)、外膜蛋白相关基因(oma87和ompH)、超氧化物歧化酶相关基因(sodA，sodC，tbpA)、唾液酸激酶相关基因(nanH)和透明质酸酶相关基因(pmHAS)共14对毒力基因的检出率高达100%；此外，铁摄取相关基因(hgbB)、唾液酸激酶相关基因(nanB)和毒素相关基因(toxA)共3对毒力基因的检出率为0。剩余的6对毒力基因：黏附素相关基因hsf-1、tadD和pfhA的检出率分别为22.6%、77.4%和96.8%；铁摄取相关基因hgbA的检出率为77.4%；外膜蛋白相关基因plpB的检出率为93.6%；外膜蛋白相关基因ompA的检出率为96.8%。以上结果表明，就本次研究的23种毒力基因而言，引起牛呼吸道综合征(BRDC)的A型多杀性巴氏杆菌中携带的毒力基因较多，携带个数在17–19个之间，且相似度较高，表明A型多杀性巴氏杆菌的亲缘关系可能较为相近，有待于进一步研究。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌通常被认为是引起牛发生肺炎的首要或次要病原体^[8]。Blanco-Vutio等^[9]通过调查发现，在引起BRDC的多杀性巴氏杆菌中，A型菌株与D型菌株分别占61%和25%。而根据Dabo等^[10]以及Ewers等^[11]的报道，A型菌株的比例甚至可以占到80%以及92%。本研究在分型方面的结果与国外文献报道基本一致。除此之外，在本次分离多杀性巴氏杆菌的过程中，还发现了其与牛支原体发生混合感染的情况，提示牛呼吸道综合征发病情况的复杂性。这一发现也可以从Virtala等^[12]的报道中得到验证。

黏附素是具有黏附作用的细菌结构成分的总称。通常是细菌表面的一些大分子结构物质。其中一种黏附素相关基因pfhA编码产生的血凝素是一种重要的流行病学标记，并且与牛疾病的发生有着密切联系^[13]。在本研究中，4种黏附素相关基因的检出率达到了100% (fimA、hsf-2、ptfA和pfhA)。外膜蛋白是外膜中镶嵌的多种蛋白质的总称，包括微孔蛋白及脂蛋白等。革兰氏阴性菌的外膜蛋白具有不同的功能包括促进铁吸收、耐抗菌以及抗血清等^[14]，以便病原菌适应各种不同的环境变化。本研究中4种外膜蛋白毒力因子(oma87，ompA，ompH和plpB)的检出率均达90%，表明外膜蛋白毒力因子分布的广泛性。铁元素的获取和利用能力对于细菌的生存来说是至关重要的，许多细菌已经发展出了不同的获取与利用手段。多杀性巴氏杆菌能利用hgbA和hgbB蛋白从血红素中直接获取铁元素^[15]。除此之外，tonB蛋白被认为能协助运输铁复合物进入细菌内部^[16]。在本研究检测的6种铁摄取相关基因中，有5种毒力基因都被检出，表明多杀性巴氏杆菌获取铁能力的多样化。

超氧化物歧化酶是生物体内一种重要的抗氧化酶，几乎存在于所有需氧细菌中^[17]。在本研究以及国外报道^{[11, 22]}中，sodA和sodC的检出率均达到了100%。然而，值得一提的是，另外一种超氧化物歧化酶tbpA的检出率则有所不同，分别为100%、70.2%和80.5%。tbpA基因编码的转铁结合蛋白，在细菌摄取和利用铁的过程中发挥了关键作用。唾液酸激酶在多杀性巴氏杆菌定殖于上皮细胞表面时发挥着重要作用。它能通过暴露主要宿主受体和降低黏蛋白的有效性来提高细菌毒力^[18]。就本研究中A型菌株的两种唾液酸激酶(nanB和nanH)而言，nanH的检出率为100%而nanB的检出率则为0，提示唾液酸激酶nanB在多杀性巴氏杆菌中的分布具有一定的偏嗜性。toxA基因编码产生的皮肤坏死性毒素最早被发现存在于D型多杀性巴氏杆菌中且可以引起猪萎缩性鼻炎^[19]。随后，据Jaglic等^[20]的报道，分离自猪、牛等多种宿主的A型多杀性巴氏杆菌中同样存在着toxA基因，表明了该基因分布的多样性。然而，该基因编码的毒素与患病牛的病理变化之间的联系并未得到验证。

就同一类毒力基因而言，在本研究中黏附素相关基因fimA、hsf-2、ptfA和pfhA的检出率显著高于hsf-1和tadD的检出率(P < 0.05)，铁摄取相关基因的检出率exbB、exbD、Fur、tonB的检出率显著高于hgbA和hgbB的检出率(P < 0.05)，唾液酸激酶相关基因nanH的检出率显著高于nanB的检出率(P < 0.05)，而其他4类毒力基因则无显著差别。比较而言，本研究中A型牛源多杀性巴氏杆菌的毒力基因筛查结果与以往报道有较大差异，Gharibi^[21]等检测了巴氏杆菌A型的11种毒力因子，9种毒力因子的检出率与本次结果差异显著(P < 0.05)，分别为ptfA、pfhA、nanB、nanH、ompH、hgbA、hgbB、toxA以及sodA。而Katsuda等^[22]检测的15对毒力基因中，有7种毒力因子与本研究存在显著差异(P < 0.05)。综上所述，存在于牛源多杀性巴氏杆菌的毒力因子分布呈现多样化，而本研究分离出的牛源多杀性巴氏杆菌毒力因子分布情况较为集中。尽管如此，本研究中分离株的毒力强弱情况较国外分离株相比并未明确，因为携带毒力基因的多少与致病性强弱之间的关系尚待研究，且不同类毒力基因之间的致病性强弱也有待鉴定。但值得注意的一点是，聚类分析发现(图 4) C1群多杀性巴氏杆菌较为特别，该群菌株携带额外毒力基因(hsf-1)，且有2种毒力基因(tadD和hgbA)缺失。不仅如此，C1群菌株的16S rRNA遗传进化关系为同一分支，提示着其亲缘关系可能与其携带的特定毒力基因存在一致性。该结论为多杀性巴氏杆菌的流行病学和致病性分离提供了新的思路。