2018, Vol. 58中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 刘凡, 周新虎, 陈翔, 陈坚, 堵国成, 方芳. 2018
- Fan Liu, Xinhu Zhou, Xiang Chen, Jian Chen, Guocheng Du, Fang Fang. 2018
- 洋河浓香型白酒发酵过程酒醅微生物群落结构解析及其与有机酸合成的相关性
- Microbial community of fermented grains and its correlation with organic acids biosynthesis during Yanghe strong-aroma liquor manufacturing process
- 微生物学报, 58(12): 2087-2099
- Acta Microbiologica Sinica, 58(12): 2087-2099
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-20
- 修回日期：2018-03-09
- 网络出版日期：2018-03-21
引用本文 |
2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室, 江苏 无锡 214122;
3. 江苏洋河酒厂股份有限公司, 江苏 宿迁 223800;
4. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 江苏 无锡 214122;
5. 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122
2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
3. Jiangsu Yanghe Distillery Co. Ltd., Suqian 223800, Jiangsu Province, China;
4. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
5. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
浓香型白酒窖内发酵过程是一种多菌种参与的固态发酵过程[1]。来自酒曲、窖池及发酵环境的多种微生物(细菌、酵母菌和霉菌)以酒醅为载体，在白酒窖内发酵过程中进行复杂的物质能量代谢，生成各类代谢产物和风味物质[2-3]。由于白酒窖内发酵环境的变化，酒醅微生物群落呈一种动态、有规律的演变过程[4]。发酵过程中某些因素的改变往往会引起微生物群落结构的改变，从而引起白酒风味物质的组成和比例发生变化，进而影响白酒品质[5-6]。
有机酸是浓香型白酒中一类重要的呈味物质。在浓香型白酒中己酸、乙酸、丁酸和乳酸的含量最高，其总和占总有机酸含量的90%以上，因此被统称为四大酸[7]。四大酸也是己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯这四种酯类的主要前体，其中己酸乙酯是浓香型白酒的主体香成分，对浓香型白酒风格的形成有重要作用[8-9]。以四大酸为主的有机酸是影响白酒酸度的主要因素。有机酸的合成主要由微生物的代谢产生[10]，而窖池中酸度的变化对微生物的生长代谢也有显著影响[11]。因此，解析白酒发酵过程中酒醅微生物群落结构与四大酸的相互作用，对于揭示酒醅微生物产酸机理、控制窖内发酵和保障白酒品质的稳定性具有重要意义。
目前，随着宏基因组测序技术在传统发酵食品中的广泛应用，微生物群落结构与功能之间的关系成为研究人员关注的热点问题。王宗敏等通过分析镇江香醋发酵过程中微生物群落结构与风味物质的相关性，找到7种对风味物质有突出贡献的核心功能微生物[12]；王海燕等利用分子生物学技术解析酱香型白酒中两个发酵轮次的酵母菌群落结构，结合两轮次风味组分变化特点，阐释了酵母群落结构变化对白酒风味物质的影响[13]。王鹏等利用高通量测序技术确定了白酒发酵过程中的核心微生物，揭示了环境因子与该核心微生物群的相互关系[14]。然而，在分子生物学水平上对白酒酒醅微生物群落与有机酸合成的相互关系研究较少，目前仅有对可培养微生物与有机酸合成进行关联分析的研究[15-16]。
本研究利用宏基因组测序技术全面系统地解析浓香型白酒发酵过程酒醅微生物群落结构，通过解析酒醅微生物与四大酸的相互关系，揭示白酒窖内发酵过程中与四大酸合成相关的微生物，可为阐明酒醅中微生物产酸机理，定向调控白酒生产中的主要有机酸的合成提供理论依据和实践参考。
1 材料和方法 1.1 酒醅样品的获取酒醅样品取自江苏洋河酒厂浓香型白酒窖池，每个样品分别于窖池的上、中、下三层采集，每层分3个点取样，合并混合均匀后作为该时间点的酒醅样品(约200 g)。在60 d的发酵周期内，分别从两个窖池取发酵0、3、6、15、20、30、45和60 d的样品，总计16个样品。样品采集后暂存于-20 ℃，并及时进行酒醅微生物基因组DNA提取和有机酸含量检测。
1.2 有机酸含量分析 1.2.1 样品的预处理:准确称取10 g酒醅样品，加入20 mL去离子水，冰浴超声均质后离心5 min (4 ℃，10000 r/min)，取上清液用于后续分析。
1.2.2 乳酸的检测:取1 mL上述上清液，用0.22 μm水系滤膜过滤，利用高效液相色谱法测定乳酸含量[17]。检测器为紫外检测器，色谱柱为HPLC organic acid analysis column (300 mm×7.8 mm)。
1.2.3 乙酸、己酸和丁酸的检测:利用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)对酒醅中的乙酸、己酸和丁酸进行定量分析。分别取8 mL样品上清液、10 μL的乙酸正戊酯溶液(内标，终浓度为440 mg/L)和5 g氯化钠加入到15 mL的顶空瓶中，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶，50 ℃水浴下萃取45 min，萃取完毕后将萃取头手动插入气相色谱进样口进行GC-MS分析。GC-MS检测色谱柱为DB-WAX石英毛细柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm；J & W Scientific)，载气He，流速2 mL/min。程序升温：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min的速度升温至230 ℃ (保持15 min)。进样口及检测器温度均为250 ℃。质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)源，离子源温度230 ℃，电子轰击能量70 eV，溶剂延迟时间3 min，质谱扫描范围35-450 m/z[18]。
1.3 酒醅微生物基因组DNA提取利用石英砂结合CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)的样品预处理方法提取酒醅微生物基因组DNA[19]。称取5 g酒醅，加入3 g灭菌石英砂和10 mL CTAB抽提液(2% CTAB，5 mol/L氯化钠，1 mol/L三氨基甲烷(pH 8.0），0.5 mol/L乙二胺四乙酸)，利用Fast prep细胞破碎仪破碎细胞(间歇操作，用冰浴控制样品温度在4 ℃以下)，离心10 min (4 ℃，10000 r/min)取上清液，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25﹕4﹕1)抽提后，离心20 min (4 ℃，10000 r/min)取上清液，加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h，沉淀用75%乙醇(乙醇﹕水为3﹕1)洗涤，提取得到的基因组DNA用TE溶解，并于-20 ℃保存。
1.4 宏基因组测序及序列分析利用Illumina HiSeq测序平台，分别对酒醅细菌和真菌微生物群落进行分析。细菌选择16S rRNA基因的V3-V4测序区域，所用引物为341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)；真菌测序区域选择ITS1区域，所用引物分别为ITS5- 1737F (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)。根据选定的特定测序区域，利用带Barcode的特异引物进行PCR，PCR扩增程序参照文献[20]。然后用2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，根据PCR产物的浓度进行等量混样和纯化，并使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit构建文库，最后通过HiSeq2500 PE250平台上机测序。
根据条码序列和PCR扩增引物序列将下机数据拆分到各样品数据，去掉Barcode序列和引物序列，得到有效的序列文件。在此基础上对测序数据的质量进行控制，去掉测序质量不好的序列，保留测序长度大于400 bp (细菌)或300 bp (真菌)的序列，并去除嵌合体序列，得到合格的有效数据。利用Uparse软件在97%的一致性水平将序列聚集为OTUs (the Operational Taxonomic Units)，细菌利用Mothur方法与SILVA的SSU rRNA数据库进行物种注释分析[21-22]，真菌利用Qiime软件中的BLAST方法与Unit数据库进行物种注释分析[23]。使用Mothur软件计算样品的Chao1、Shannon和Goods-coverage指数。
1.5 数据处理及统计学分析基于属水平相对丰度排名前100的酒醅微生物(真菌和细菌)，利用SPSS 19.0统计软件对酒醅样品进行PCA聚类分析，利用R中的ggbiplot进行PCA结果的可视化。利用SIMCA 13.0软件对所有酒醅样品相对丰度排名前10的属(细菌和真菌)与四大酸含量进行偏最小二乘回归分析(partial least squares regression，PLS)，PLS模型的R2和Q2值分别说明自变量对因变量的解释能力和预测能力，R2(> 0.8)和Q2值(> 0.5)越大，说明模型的拟合效果和预测能力越好[12]。微生物的VIP值(variable importance plot)和相关性系数矩阵用于确定与四大酸合成相关的功能微生物。VIP值大于1.0，表明微生物对四大酸合成有重要作用，且VIP值越大说明重要程度越大[24]。相关性系数矩阵说明微生物与四大酸合成的相关性，1 > r > 0代表正相关，0 > r > -1代表负相关。通过Cytoscape 3.4.0软件对微生物与四大酸相关性较高的(|r| > 0.6)进行可视化。
2 结果和分析 2.1 浓香型白酒窖内发酵过程中四大酸合成规律通过对浓香型白酒发酵过程中的己酸、丁酸、乳酸和乙酸的含量进行检测发现，酒醅中己酸、乙酸和乳酸含量在窖内发酵前期有一个降低的过程。其中以乙酸含量降低幅度最大，在0-6 d降低了10.82 mg/kg，降幅为59.1%。随着发酵的进行，丁酸合成存在2个快速增长阶段：6-15 d和45-60 d；乙酸含量在15-20 d迅速增加，增加了2.3倍；乳酸含量在发酵第20-30 d增加了43.1%。酒醅中己酸含量在入窖和出窖时没有显著变化，出窖时丁酸、乳酸和乙酸含量分别比入窖时增加了54.99、1732.41和110.54 mg/kg (图 1)。
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| 图 1 白酒发酵过程酒醅中四大酸含量变化 Figure 1 Content of hexanoic acid (A), butanoic acid (B), lactic acid (C) and acetic acid (D) in fermented grains. |
2.2 酒醅微生物的α-多样性分析
本研究利用宏基因组测序技术对浓香型白酒发酵过程酒醅中微生物群落结构进行了解析。经过对测序获得数据的拼接和过滤处理，16个酒醅样品共得到857338条细菌有效序列和791098条真菌有效序列。所有样品的覆盖率指数(Good coverage)均达到99.61%以上，表明样品的测序深度满足反映酒醅微生物全部信息的要求。酒醅中微生物多样性结果如表 1，在97%的相似性水平上，各样品中细菌OTUs为168-925，真菌OTUs为173-246，即细菌种类普遍高于真菌种类。
| Microorganisms | Samples/d | OTUs | Chao1 | Shannon | Good coverage/% |
| Bacteria | 0 | 458±41 | 531.39±42.02 | 3.63±0.42 | 99.71±0.01 |
| 3 | 925±77 | 1025.04±97.64 | 5.64±0.64 | 99.55±0.01 | |
| 6 | 780±71 | 885.35±70.64 | 4.56±0.32 | 99.61±0.01 | |
| 15 | 369±28 | 426.57±35.01 | 1.79±0.85 | 99.75±0.01 | |
| 20 | 361±57 | 454.37±45.52 | 0.95±0.09 | 99.72±0.02 | |
| 30 | 314±58 | 409.93±80.77 | 0.57±0.14 | 99.75±0.01 | |
| 45 | 288±65 | 343.24±64.72 | 0.68±0.16 | 99.83±0.01 | |
| 60 | 168±17 | 198.11±24.80 | 0.91±0.03 | 99.92±0.02 | |
| Fungi | 0 | 173±27 | 254.14±56.38 | 1.85±0.07 | 99.75±0.01 |
| 3 | 198±26 | 234.81±26.43 | 2.41±0.23 | 99.85±0.01 | |
| 6 | 191±71 | 235.89±90.53 | 2.42±0.11 | 99.85±0.01 | |
| 15 | 241±13 | 316.38±20.33 | 2.99±0.41 | 99.81±0.00 | |
| 20 | 173±49 | 225.92±62.31 | 2.87±0.02 | 99.85±0.01 | |
| 30 | 197±28 | 220.44±14.09 | 3.25±0.22 | 99.93±0.02 | |
| 45 | 234±25 | 301.48±35.83 | 3.77±0.38 | 99.91±0.02 | |
| 60 | 246±7 | 276.86±0.51 | 3.81±0.28 | 99.83±0.01 |
2.3 酒醅微生物群落结构分析
细菌属水平共得到496个属，其中地芽孢杆菌属(Geobacillus)和乳杆菌属的相对丰度在浓香型白酒窖内发酵整个阶段均占据优势(丰度 > 1%的菌确定为优势菌)。窖内发酵0-6 d阶段地芽孢杆菌在细菌中占绝对优势，含量为21.5%-40.3%。窖内发酵6 d后地芽孢杆菌相对丰度迅速降低，逐渐被乳杆菌属替代，6-15 d乳杆菌属相对丰度增加了59.7%，15 d后成为绝对优势属(占细菌总数的79.7%-95.7%)。在窖内发酵前期，芽孢杆菌属(Bacillus)和醋酸杆菌属(Acetobacter)也是优势细菌，芽孢杆菌和醋酸杆菌的相对丰度分别为8.5%-12.2%和0.3%-5.1%。这一时期，高温放线菌属(Thermoactinomyces)(18.2%到3.5%)占据比例则迅速下降。此外，在白酒窖内发酵前期，魏斯氏菌属(Weissella)、Kroppenstedtia、无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)和乳球菌属(Lactococcus)也占据一定的比例，这些微生物均为白酒发酵前期的优势细菌(图 2)。
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| 图 2 浓香型白酒发酵过程中酒醅细菌(A)和真菌(B)属水平微生物群落结构 Figure 2 The microbial community of fermented grains for production of strong-aroma Chinese liquor. A: bacteria; B: fungi. The results were the average values of sequencing data generated from two different batches of fermentation. |
真菌属水平共鉴定出134个属，其中嗜热真菌属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)和根毛霉属(Rhizomucor)在浓香型白酒窖内发酵整个阶段均为优势菌属(相对丰度 > 1%)。窖内发酵0-6 d时嗜热真菌(32.9%-40.9%)和热子囊菌(43.8%-50.2%)所占比例较高，6 d后相对丰度降低，但仍高于17%；根毛霉相对丰度在入窖时最低(4.3%)，随后不断升高，30 d时所占比例达到10.8%。与细菌不同的是，在白酒窖内发酵中后期，存在多个优势真菌。例如窖内发酵6-15 d，Naumovozyma (2.1%到30.9%)相对丰度迅速增加，在15-20 d占据较高比例(21.9%- 30.9%)，是白酒窖内发酵整个过程中相对丰度最高的酵母菌。伊萨酵母属在窖内15-60 d也是优势菌(相对丰度 > 1%)。假散囊菌属(Pseudeurotium)在窖内发酵15-30 d相对丰度由0.7%增加到28.3%，30-45 d保持较高比例(17.9%-28.3%)。集壶菌属(Synchytrium)仅在发酵45 d相对丰度较高(8.9%)。此外，毕赤酵母属(Pichia)、毛霉属(Mucor)、丝孢菌属(Scedosporium)和酵母属在白酒窖内发酵中后期也占据一定比例，均为窖内发酵酒醅中的优势真菌(图 2)。
2.4 酒醅微生物群落结构与对浓香型白酒窖内发酵进程关联分析由上述浓香型白酒窖内发酵过程酒醅微生物群落演替规律可知，窖内发酵前期和中后期酒醅微生物群落组成存在明显差异(图 2)。白酒窖内发酵6-15 d是酒醅微生物群落结构剧烈变化时期，属水平优势细菌数目显著减少，优势真菌数目显著增多，这与该阶段窖池营养物质快速消耗、氧气含量降低、酸度迅速升高密切相关[4]。为研究酒醅微生物群落结构变化与白酒窖内发酵进程的关系，基于酒醅属水平相对丰度排名前100的细菌和真菌微生物，对酒醅样品进行了PCA聚类分析。由图 3可以看出，在95%的置信区间内，代表不同微生物组成的酒醅样品主要分布在第一和第三象限，第15天酒醅与其他酒醅在微生物组成上较为不同，是发酵前期(0-14 d)到中后期(16-60 d)的一个转折点。由于窖内发酵是一种可循环的持续发酵过程[25]，在后续研究中，将分0-15 d和15-60 d两个阶段对酒醅微生物群落结构和它们与四大酸相关性进行研究。
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| 图 3 基于微生物组成的酒醅样品PCA分析 Figure 3 Grouping fermented grains by PCA analysis based on top 100 classified genera of bacteria and fungi. |
2.5 白酒窖内发酵过程中与四大酸合成相关的微生物的重要性指标分析
微生物的重要性指标(variable importance plot，VIP)分析是评估微生物对风味物质重要程度的有效手段[24]。本研究利用SIMCA 13.0软件对每个酒醅样品相对丰度排名前10的细菌(18个属)和真菌(17个属)与四大酸含量进行了偏最小二乘回归分析。其中，白酒窖内发酵0-15 d，PLS模型的R2和Q2分别为0.821和0.549，15-60 d的PLS模型R2和Q2分别为0.954和0.625，说明构建的PLS模型能很好地对白酒发酵过程中酒醅微生物与四大酸的相关性进行解释。在白酒窖内发酵整个过程中VIP值大于1.0的微生物有15种，包括8个细菌属和7个真菌属(图 4)。窖内发酵0-15 d (图 4-A)，VIP值大于1.0的微生物有28个属(16细菌和12真菌)，其中VIP值最大的细菌属为unidentified Chloroplast (VIP=1.27)，真菌属为伊萨酵母属(VIP=1.25)。窖内发酵15-60 d (图 4-B)，VIP值大于1.0的微生物有17个属(9细菌和8真菌)，其中细菌VIP值最大的为不动杆菌属(Acinetobacter) (VIP=1.35)，真菌为Naumovozyma (VIP=1.29)。上述结果表明，白酒窖内发酵0-15 d (28属)对四大酸合成有重要作用的微生物数目明显多于15-60 d (17属)。
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| 图 4 与四大酸合成相关的重要微生物 Figure 4 The important microbe correlated with the four main organic acids. A: 0-15 d; B: 15-60 d. |
2.6 白酒窖内发酵过程中与四大酸相关的微生物分析
为进一步确定与四大酸合成相关的功能微生物，选择白酒窖内发酵两个阶段VIP值大于1.0的微生物与四大酸含量进行相关性系数矩阵分析，并利用Cytoscape软件对|r| > 0.6的进行可视化展示。由图 5可以看出，在浓香型白酒窖内发酵整个过程，乳杆菌属与乳酸合成正相关，酵母属和Naumovozyma与乳酸合成负相关；乳杆菌属和伊萨酵母属与乙酸合成正相关，嗜冷芽孢杆菌属与乙酸合成负相关；酵母属与己酸合成正相关；酵母属与丁酸合成正相关，葡萄球菌属和根霉属与丁酸合成负相关。由此，将这些微生物定义为在白酒窖内发酵整个过程中对四大酸合成有重要影响的核心微生物。
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| 图 5 酒醅微生物与四大酸的相关性网络图 Figure 5 Network of microbial genera (green) and four main organic acids (pink) constructed by coefficient matrix analysis (|r| > 0.6). A: 0-15 d; B: 15-60 d. |
窖内发酵0-15 d，微生物与四大酸有64对相关性连接，包括33对正相关和31对负相关。其中与丁酸相关联的微生物数目最多(20属)，包括6对正相关和14对负相关，毕赤酵母、酵母属、毛霉、Naumovozyma与丁酸合成正相关性最强(r > 0.9)；嗜热真菌、根霉、肠杆菌属(Enterobacter)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)是影响丁酸合成的主要负相关微生物(r < -0.9)。与乳酸合成相关联的有16个属，包括11对正相关和5对负相关，其中地芽孢杆菌、无氧芽孢杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌属、乳球菌与乳酸合成正相关性最强(r > 0.9)，毕赤酵母与乳酸合成负相关性最强(r < -0.8)，表明这些微生物是该阶段影响乳酸合成的主要微生物。与乙酸合成相关联的有14个属，包括11对正相关和3对负相关，其中醋酸杆菌、乳杆菌属、不动杆菌、高温放线菌与乙酸合成正相关性最强(r > 0.9)，假丝酵母属(Candida)是与乙酸合成负相关性最强的微生物(r < -0.7)。与己酸合成相关联的微生物最少(14属)，包括5对正相关和9对负相关，醋酸杆菌属是与己酸合成正相关性最强的微生物(r > 0.9)，集壶菌、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)和己酸合成负相关性最强(r < -0.9)。此外，窖内发酵0-15 d与两种以上有机酸均正相关的微生物包括细菌魏斯氏菌、unidentified Chloroplast、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、乳杆菌属、地芽孢杆菌、芽孢杆菌、无氧芽孢杆菌、不动杆菌、醋酸杆菌属、高温放线菌和真菌伊萨酵母属、酵母属；负相关的包括细菌嗜冷芽孢杆菌和真菌集壶菌、复膜孢酵母、根毛霉、伊萨酵母、假丝酵母、曲霉属(Aspergillus)，这些微生物定义为白酒窖内发酵0-15 d与四大酸合成相关的关键微生物。
白酒窖内发酵15-60 d，微生物与四大酸有32对相关性连接，包括14对正相关和18对负相关。与乳酸合成相关联的微生物最多(14属)，包括5对正相关和9对负相关，其中乳杆菌属、根毛霉是影响乳酸合成的主要正相关微生物(r > 0.9)，Naumovozyma、地芽孢杆菌、好氧芽孢杆菌属(Aeribacillus)与乳酸合成负相关性最强(r < -0.9)。与乙酸合成相关联的微生物有9个属，其中乳杆菌属、伊萨酵母、复膜孢酵母与乙酸合成正相关，而嗜冷芽孢杆菌、不动杆菌是与乙酸合成负相关性最强的微生物(r < -0.8)。与己酸和丁酸相关联的微生物较少(4属和5属)，其中微生物与己酸均为正相关，与丁酸有2对正相关和3对负相关。酵母属是影响己酸和丁酸合成正相关性最强的微生物(r > 0.9)，表明酵母属微生物对己酸和丁酸合成有重要作用[7]。同时，该阶段与两种以上有机酸合成均正相关的微生物包括乳杆菌属和真菌中的复膜孢酵母、酵母属、伊萨酵母；负相关的微生物包括细菌葡萄球菌、嗜冷芽孢杆菌、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、无氧芽孢杆菌、不动杆菌和真菌Naumovozyma，这些微生物定义为白酒窖内发酵15-60 d影响四大酸合成的关键微生物。
本研究中梭状芽孢杆菌属(Clostridium)与四大酸合成相关性均较低(|r| < 0.6)，且在酒醅微生物群落中所占比例也极低(相对丰度 < 0.01%)。浓香型白酒发酵过程中梭状芽孢杆菌是影响己酸、丁酸合成的关键微生物，通常在窖泥中进行强化[26]。因此，探究酒醅微生物中与己酸、丁酸合成相关联的其它微生物，对于寻找浓香型白酒窖内发酵过程中己酸和丁酸合成的调控方法有一定的参考价值。
3 讨论本研究利用高效液相色谱、HS-SPME结合GC-MS分别对浓香型白酒发酵过程酒醅中乳酸和己酸、丁酸、乙酸含量进行了分析，发现酒醅四大酸含量在白酒发酵过程中均有不同程度的变化，其中在白酒发酵结束时，乙酸、乳酸和丁酸含量均明显升高，己酸含量与发酵0 d相比无显著差异。这与之前报道的利用生物传感分析仪和高效液相色谱等检测浓香型白酒发酵过程酒醅中乳酸含量，利用液液萃取结合气相色谱技术分析酒醅中己酸、丁酸和乙酸变化规律的结果基本一致[27-28]。利用宏基因组测序技术解析了白酒窖内发酵过程中酒醅微生物群落结构，发现窖内发酵前期细菌组成较丰富，而窖内发酵中后期真菌种类丰富。通过对酒醅微生物群落进行PCA聚类分析，酒醅中微生物构成被明显区分为0-15 d和15-60 d两个阶段，这与白酒发酵前期和中后期窖池环境变化密切相关[4]。进一步对窖内发酵两个阶段属水平优势微生物(细菌和真菌)与四大酸含量进行偏最小二乘回归分析，可知发酵0-15 d (28属)对四大酸合成有重要影响的微生物数目显著高于15-60 d (17属)。根据微生物与四大酸的相关性系数矩阵，在白酒窖内发酵整个阶段，共揭示出7个与四大酸合成密切相关的属水平核心微生物：乳杆菌属、伊萨酵母属、酵母属、Naumovozyma、葡萄球菌属、嗜冷芽孢杆菌属和根霉属。乳杆菌属是白酒窖内发酵整个过程中的优势细菌，它们在多种发酵食品中均有生成乙酸、乳酸和其他风味物质的能力[29-30]。伊萨酵母、酵母属和Naumovozyma是浓香型白酒酒醅中的优势酵母菌。其中伊萨酵母具有代谢产生乙酸的能力[31]，酵母属微生物和Naumovozyma产生的乙醇可与乙酸、乳酸反应产生己酸和丁酸，在一定程度上抑制窖内发酵中乳酸及乙酸的合成[7]。葡萄球菌具有产生多种风味物质的潜力，有促进乙醇、醛类和酯类物质合成的能力[32]；嗜冷芽孢杆菌有较强的抑菌活性，能显著抑制产酸微生物的生长代谢[33]；根霉有产生脂肪酶和酒精的能力，能快速催化有机酸和乙醇生成酯类物质[34]，这些微生物在白酒窖内发酵过程中对有机酸合成均有重要作用。
本研究在分析酒醅主要有机酸含量和微生物群落结构演替规律的基础上，通过多元统计分析手段，全面揭示了白酒窖内发酵过程中与主要有机酸合成相关联的微生物，可为阐明酒醅微生物产酸机理、定向控制白酒窖内发酵过程中有机酸含量提供理论依据。
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