放线菌是一类具有重要经济价值的革兰氏阳性细菌，已知的微生物生物活性物质中，约有40%是由放线菌产生的，包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗肿瘤制剂、杀虫剂、除草剂、免疫抑制剂等^[1-2]。在医药工业上广泛应用的抗生素中，约70%是由放线菌产生的^[1]。而且，放线菌在环境有机质的降解矿化、矿物营养固定、固氮、改善环境理化参数等方面也扮演着重要生态角色^[3-4]。

放线菌在自然界中分布广泛，近年来，为了获取新的放线菌资源，人们逐渐将目光投向一些特殊生境，如深海、沙漠、盐湖等^[5]。青藏高原是世界上海拔最高的高原，有“世界屋脊”和“第三极”之称，其高海拔、低气温、长日照、强辐射等气候特征赋予了该地域特殊的土壤微生物资源，也可能赋予该地域微生物特殊的次级代谢能力和生态功能。近20年来，我国科研人员对青藏高原土壤放线菌的多样性、生物学活性、降解特性等进行了一系列研究^[6-8]，结果表明青藏高原土壤中放线菌的多样性丰富，具有生物活性的放线菌种类较多，而且还存在一些未知的放线菌，值得我们对该“世界屋脊”的放线菌开展进一步研究。本研究中，我们采用了青藏高原北部的西藏阿里、那曲和青海海西地区的土壤样品，希望能够进一步阐明该地域土壤可培养放线菌的多样性，并对其新颖性进行评估。

在放线菌的分离培养方面，已经发展出了若干种选择性培养基和预处理方法^[9]。藤黄微球菌是放线菌成员之一，其细胞在长期的静置培养过程中会进入类似休眠的VBNC (viable but non-culturable)状态，并且该菌在生长后期能够分泌一种本质为小分子蛋白质的复苏促进因子Rpf (Resuscitation promoting factor)，不仅能够促进其自身处于VBNC状态细胞的复苏，而且能够促进与之近缘的革兰氏阳性细菌的复苏生长^[10-11]。因此，本研究中我们尝试在分离培养基中添加藤黄微球菌发酵液，以期促进青藏高原土壤中放线菌的复苏生长和分离培养。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 土壤样品: 14份土样由中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室提供，其中5份采自西藏阿里地区，5份采自西藏那曲地区，4份采自青海海西蒙古族藏族自治州。采样点海拔4400-5000 m，采样时间为2011年7-8月，样品置于无菌自封袋内，室温运回实验室后-80 ℃保藏。采样信息见表 1。

1.1.2 主要试剂和仪器: 细菌基因组提取试剂盒和2×PCR mix (含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂)购自北京博迈德基因技术有限公司，DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR仪、电泳仪及凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；离心机购自德国Eppendorf公司，恒温培养箱购于上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，摇床、超净工作台购于北京东联哈尔仪器制造有限公司。培养基中涉及的所有试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 分离培养基: 培养基M1-M7参照文献[8]：M1，淀粉甘油脯氨酸培养基；M2，组氨酸棉籽糖培养基；M3，纤维素培养基；M4，木糖酪蛋白培养基；M5，腐殖酸培养基；M6，几丁质培养基；M7，丙酸钠酪蛋白培养基。各培养基添加15%的琼脂制成固体培养基。

1/4 GYM (稀释的葡萄糖酵母麦芽汁培养基)：葡萄糖1.000 g，酵母提取物1.000 g，麦芽提取物2.500 g，CaCO₃ 0.500 g，放线菌酮0.050 g，新生霉素0.005 g，氨曲南0.025 g，琼脂15.000 g，蒸馏水1000 mL。

1/4 GYM+F：藤黄微球菌在1/4 GYM液体培养基中28 ℃、200 r/min揺瓶培养20 d然后在室温静置1周，静置后的上清液经0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，获得藤黄微球菌无菌发酵液。倒平皿前将1/4 GYM与藤黄微球菌无菌发酵液3:1 (V/V)混合。

1.2 样品预处理

土壤样品于进行菌种分离前2周自然风干。取2.0 g风干的样品加入含18 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，内置无菌玻璃珠，28 ℃、180 r/min振荡2 h。随后进行水浴超声波处理，超声功率100 W、频率40 kHz，水浴温度28 ℃，处理时间40 min。

1.3 菌株分离培养、纯化及保藏

将预处理后的土壤悬浮液做梯度稀释，选10^-2和10^-3稀释度样品涂布于上述分离培养基平皿，每个平皿接种100 μL，每个稀释度设3个平行。分离平皿于28 ℃倒置培养2-3周后观察菌落生长情况，挑取单菌落至GYM培养基上纯化。根据纯化菌落的培养特征和样品来源进行去重复，刮取去重复后的纯培养物于20%甘油中-80 ℃保藏。

1.4 菌株16S rRNA基因测序和序列分析

菌株DNA提取按Chun等方法进行^[12]。16S rRNA基因的PCR扩增和测序引物均为通用保守引物27f和1492r。测序工作由北京博迈德基因技术公司完成。将分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定与之亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16S rRNA基因序列，用MEGA 6.0软件^[13]构建系统发育树。序列比对用CLUSTAL X1.8 program^[14]，进化树的构建用Maximum-Likelihood (ML)^[15]和Neighbor-Joining (NJ)方法^[16]。

为进一步研究分离菌株的物种多样性，使用QIIME软件^[17]中的Uclust^[18]程序，以16S rRNA基因序列相似性99%为阈值^[19]，将分离菌株划分为不同的操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。

2 结果和分析 2.1 放线菌多样性分析

用分离培养基M1-M7对所有14份样品进行了分离，纯化去重复后得到放线菌177株；随后又用培养基1/4 GYM和1/4 GYM+F对样品1-8 (即编号为P797、P798、P799、P801、P804、P813、P015-B和P022-B的样品)进行了分离，得到放线菌78株。共获得放线菌255株，分布于放线菌门的8个目，分别是棒杆菌目(Corynebacteriales)、姜氏菌目(Jiangellales)、微球菌目(Micrococcales)、小单孢菌目(Micromonosporales)、丙酸杆菌目(Propionibacteriales)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)、链霉菌目(Streptomycetales)和链孢囊菌目(Streptosporangiales)；14个科，分别是博戈里亚湖菌科(Bogoriellaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、姜氏菌科(Jiangellaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、小单孢菌科(Micromonospora)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、原小单孢菌科(Promicromonosporaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)和高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)；23个属：马杜拉放线菌属(Actinomadura)、放线孢菌属(Actinomycetospora)、壤霉菌属(Agromyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、柠檬球菌属(Citricoccus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、乔治菌属(Georgenia)、姜氏菌属(Jiangella)、韩国生工菌属(Kribbella)、考克斯菌属(Kocuria)、伦茨菌属(Lentzea)、微杆菌属(Microbacterium)、小单孢菌属(Micromonospora)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、野野村氏菌属(Nonomuraea)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、红球菌属(Rhodococcus)、糖丝菌属(Saccharothrix)、链霉菌属(Streptomyces)和链孢囊菌属(Streptosporangium) (表 2)。其中链霉菌属的菌株108株，占分离菌株的42.4%，是分离培养得到的最多的属；其次是节杆菌属的菌株26株；分枝杆菌属、微杆菌属、红球菌属和壤霉菌属的菌株分别为16、15、12和12株，其他属的放线菌均不超过10株。以放线菌中常用的16S rRNA基因序列相似性99%为阈值^[19]，255株分离菌株可被划分为94个OTUs，包括47个clusters和47个singletons，可能代表了94个放线菌物种，其中链霉菌物种28个(表 2)。这表明该地区土壤可培养放线菌多样性很丰富。

分离菌株中，有13个属、25个OTUs的29株放线菌的16S rRNA基因序列与最近模式菌株的相似性低于99%，可能属于新种(表 3)。其中，属于同一OTU的菌株29-2和29-3与另一个OTU的菌株39-6的最近模式菌株都是Streptomyce specialis GW 41-1564^T，它们与后者的16S rRNA基因序列相似性分别为98.18%、98.27%和98.82%。16S rRNA基因系统发育分析显示，这3株菌与Streptomyce specialis GW 41-1564^T在链霉菌属的进化树中聚为一个很不稳定的分支；其中菌株29-2和29-3形成一个稳定的紧密小分支，菌株39-6虽然与它们聚在一起，但聚簇的支持率很低(图 1)；且菌株29-2和29-3之间的序列相似性为99.92%，但它们与菌株39-6的序列相似性仅为97.73%。表明这3株菌很可能代表链霉菌属的2个不同新种。稀有放线菌中，属于不同OTUs的菌株P015-6和P015-45的最近模式菌株都是Lentzea violacea IMSNU 50388^T，它们与后者的16S rRNA基因序列相似性分别为98.11%和98.90%。16S rRNA基因系统发育分析显示，这2株菌分别与伦茨氏菌属不同的模式菌株聚簇在一起(图 2)；菌株P015-6与Lentzea jiangxiensis FXJ1.034^T形成一个很不稳定的分支，它们序列相似性仅为97.36%；菌株P015-45与Lentzea flaviverrucosa AS4.0578^T和Lentzea violacea IMSNU 50388^T形成一个稳定的分支，与后二者的序列相似性分别为98.74%和98.90%；且菌株P015-6和P015-45之间的序列相似性仅为97.75%。表明这2株菌很可能代表伦茨氏菌属的2个不同新种。根据上述OTU分析和系统发育分析结果，这29株放线菌可能代表了13个属的至少25个新种，显示所分离土壤中存在较多的新颖放线菌类群。

2.2 不同培养基分离放线菌的效果

我们用M1-M7、1/4 GYM和1/4 GYM+F共9种培养基对采集自青藏高原腹地的样品1-8进行了分离，不同培养基分离获得的菌株数量和多样性见表 4。其中M1、M7和1/4 GYM+F 3种培养基分离获得的放线菌菌株数量和OTUs数量最多。M1分离得到放线菌41株，属于21个OTUs，其中链霉菌仅6株；M7分离到放线菌30株，属于18个OTUs，其中链霉菌8株；而M2-M4分离得到的都是稀有放线菌，M6未分离得到任何放线菌。1/4 GYM+F分离到放线菌61株，属于25个OTUs，其中绝大部分为链霉菌；而1/4 GYM分离得到的放线菌仅为17株，属于12个OTUs，其中绝大部分也为链霉菌。相比之下，加了藤黄微球菌发酵液的1/4 GYM+F培养基上获得的菌落数量明显更多，而且菌落的多样性更为丰富(图 3)。由此可见，藤黄微球菌发酵液明显有助于青藏高原土壤中放线菌的复苏生长和分离培养；9种培养基中，1/4 GYM和1/4 GYM+F比较适用于分离链霉菌，M1、M3、M4和M7比较适用于分离稀有放线菌，而M6不适用于分离青藏高原土壤放线菌。

3 讨论

本研究结果进一步说明青藏高原土壤可培养放线菌多样性非常丰富。Zhang等^[8]对青藏高原87份土壤样品进行了大量的分离工作，得到了分布于16个科、至少22个属的1930株放线菌。与之相比，本研究的分离规模小得多，但也得到了分布于14个科、23个属的放线菌；其中5个科(Brevibacteriaceae、Bogoriellaceae、Jiangellaceae、Micrococcaceae、Mycobacteriaceae)是文献研究中没有分离到的，但文献报道的7个科(Actinopolysporaceae、Actinosynnemataceae、Dermacoccaceae、Geodermatophilaceae、Glycomycetaceae、Kineosporiaceae、Propionibacteriaceae)在本研究中没有分离到。由于本研究使用的培养基涵盖了文献的培养基(M1-M7)，分离菌株在上述科分类层级上的多样性差异可能主要因为样品采集位点和数量的差异，本研究的样品采自经度80.86°-92.56°E、纬度30.12°-34.56°N，而文献样品采自经度102.30°-108.18°E、纬度27.50°-29.97°N以及新疆、云南、四川地区，两个研究的采样区域没有重叠。可见青藏高原不同地区，尤其是前人没有探究过的地区的放线菌多样性值得研究，更有可能发现新的类群。

不同放线菌的生长对营养需求存在差异，M1、M3、M4和M7培养基所含的碳源分别为淀粉甘油、纤维素、木糖和丙酸钠，这些碳源可能更适合稀有放线菌的生长。其中M1所含的营养成分相对丰富，故该培养基分离到的菌株数和多样性都较高。而1/4 GYM明显更适合链霉菌的生长，可能因为其以葡萄糖为碳源，且氮源也相对丰富。由此，可以根据分离稀有放线菌或链霉菌的不同需求来选择不同的培养基。

1/4 GYM+F培养基分离得到的链霉菌和稀有放线菌数目均是对照1/4 GYM培养基的3倍以上，物种数目也是对照的2倍以上，而且1/4 GYM+F分离得到的稀有放线菌姜氏菌属(Jiangella)和韩国生工菌属(Kribbella)在M1-M7培养基上并未分离得到。这充分说明藤黄微球菌发酵液的确能够促进放线菌的分离培养。可能是由于发酵液中含有藤黄微球菌分泌的复苏促进因子Rpf，促进了样品中与之近缘的其他放线菌的生长^[10-11]；也可能是由于长期培养的藤黄微球菌死亡后细胞壁被裂解，释放细胞壁肽聚糖成分N-乙酰葡萄糖胺等小分子物质，充当信号分子，促进了样品中放线菌特别是链霉菌的发育分化和抗生素产生^[20]，使其获得了生长优势；此外，藤黄微球菌发酵液中也可能存在某些次级代谢产物，在分离培养基中起到了生长因子的作用，从而能够促进放线菌生长。具体的促进原因有待通过进一步的实验来证明，如利用不同培养时间的藤黄微球菌发酵液进行分离培养，检测发酵液中的Rpf和次级代谢产物，以及外源添加N-乙酰葡萄糖胺进行分离培养。

目前，土壤中微生物的可培养率约为0.3%^[21]，还存在大量在实验室条件下难以培养的微生物，其中当然也包括放线菌。此外，尽管本研究分离到的放线菌多样性较高，但由于所用样品保持时间较长，可能样品中一些放线菌物种在低温长时间储存过程中丧失了生命力，无法再分离培养，结果并未充分体现采样地区可培养放线菌的多样性。因此，未来需要通过更广泛的采样和基于非培养的高通量测序分析来获得青藏高原地区土壤放线菌多样性的全景，进而通过改进选择性分离策略和方法，有针对性地分离目前培养手段尚未获得的放线菌类群。