sRNA (small non-coding regulatory RNA，sRNA)是一类存在基因间区、长度为50-500 bp的非编码RNA，在转录后水平调控靶mRNA翻译和稳定性，在调控原核生物的生理和毒力中发挥重要作用^[1-3]。随着高通量测序方法(如生物芯片、RNA-seq)的应用，越来越多的sRNA被发现，目前在大肠杆菌中发现有80多种sRNA，而在鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)中也存在RyhB、MicF、HmsA、ssrA、ssrS等多种sRNA^[4-8]，此外在鼠疫菌致病性、毒力及调控等研究中，也需要构建染色体大片段的基因敲除。随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段。

目前新一代CRISPR/Cas 9基因编辑技术具有特异切割、多基因位点突变、大片段缺失、实用等特点，但该系统可在非靶位点造成不需要的突变，甚至产生较高的脱靶率，且在很多器官组织及原代细胞中难转染，在原核生物中只成功用于肺炎链球菌和大肠埃希菌等少数细菌^[9-12]。而在原核生物中应用较广的是基于λ Red同源重组技术，2000年Datsenko等^[13]利用λ Red重组系统建立的一步PCR法基因缺失突变技术，将gam、bet和exo基因置于受阿拉伯糖诱导的ParaB启动子的控制下，构建了具有高效重组功能的低拷贝质粒pKD46，加入一定浓度的阿拉伯糖后诱导质粒pKD46表达出Exo、Beta和Gam三种蛋白质，将含有抗性基因的PCR片段电转入含有质粒pKD46的大肠埃希菌，在Red重组酶的作用下，PCR片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上靶基因发生重组，染色体上的靶基因被抗性基因所替代。其优点是用PCR合成双链线状DNA打靶分子，不需限制酶和连接酶，操作过程简单、精确和快速、经济，大大缩短了构建打靶载体的时间，成为功能基因组学研究的有利工具，适用于后基因组时代功能研究中大量突变株的构建，已成功应用于大肠埃希菌属、沙门菌属、假结核耶尔森菌属、志贺菌属、沙雷菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属等的基因敲除^[14-18]。

尽管一步法突变技术在一些革兰氏菌成功应用，但在鼠疫菌中同源重组效率较低，特别是对较短的sRNA (小于200 bp)或较长的染色体片段(大于2 kb)敲除较困难，因此构建一种适合于鼠疫菌全基因组高效的敲除方法尤为重要。RyhB是2002年在大肠埃希菌发现的一种跟铁代谢相关的sRNA，而在鼠疫菌中发现有两个同源性很高的RyhB拷贝——RyhB1和RyhB2，大小约为110 bp，在应用一步法PCR法敲除RyhB时，虽将同源臂由40 bp提高到60 bp，但仍没成功将其敲除。有文献报道提高同源臂可有效提高同源重组效率^[19]。如经克隆连接和酶切获得痢疾杆菌500-800 bp的长同源臂，在较短时间内成功地敲除了痢疾杆菌等4个基因，但方法比较繁琐、耗时；2003年，Derbise报道^[18]利用三步PCR法获得500 bp的线性打靶DNA同源臂，不必依赖于酶切连接等传统的基因工程手段，可有效敲除假结核耶尔森菌多个基因。本研究在上述方法的基础上进行改进，通过二步PCR法构建600-1000 bp的同源臂，有效提高了同源重组效率，方法简单、快速及高效，特别适合于鼠疫菌sRNA (36-200 bp)及大片段染色体(2-47 kb)的敲除，并为鼠疫菌及其他微生物基因结构与功能、表达及调控、致病性和毒力等研究提供有力的工具。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 鼠疫菌野生株201株属于田鼠型菌株，其主要表型为F1⁺ (可以形成荚膜)，LcrV⁺ (合成V抗原)，Pst⁺ (产生鼠毒素)以及Pgm⁺。质粒pKD46 (温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的gam、bet和exo基因，AmpR)、pKD4 (含有两边带有FRT位点的卡那霉素抗性基因)。

1.1.2 培养基: LB培养基(1L水加入10 g胰化蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和15 g琼脂)制备好后，高压灭菌冷却到60 ℃后，并加入相应抗性的抗生素(氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL)。

1.1.3 主要试剂: dNTP、PPrimeSTAR^TM HS DNApolymerase、TaKaRa Ex Taq购自宝生物(大连)有限公司；PCR纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自德国凯杰公司。1.2 PCR扩增目的基因的上、下游同源臂及卡那盒

针对待敲除目的基因(如sRNA和大片段染色体)上下游序列，用primer 5设计含抗性盒的上下游同源臂引物：扩增上游同源臂的一条反向引物RyhB1-Up-R-kan为5′-CGTGTAATGCTGCAATCTGGCAATGATAATCATTATCAC-3′，5′端划线部分是与卡那盒同源的序列(18 bp)，3′端未划线部分是与敲除基因上游同源的序列；扩增下游同源臂的一条正向引物RyhB1-down-F-kan为5′-GCTTCTCAGTGCGTTACATTTGCCTTTTTCTCACCCCGTTC-3′，5′端划线部分是与卡那盒同源的序列(18 bp)，3′端未划线部分是与敲除基因下游同源的序列。最终扩增的上、下游同源臂末端均含有18 bp卡那盒的同源序列，PCR产物大小一般为600-1000 bp，而扩增的卡那盒长度为1598 bp，用于后续的融合PCR (引物设计见表 1)。

PCR扩增体系(50 μL)：5×PPrimeSTAR^TM buffer 10 μL、dNTP mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，Forward primer (10 μmol/L)及Reverse primer (10 μmol/L)各1 μL、DNA模板(10 ng/μL) 4 μL、PPrimeSTAR^TM HS DNA polymerase 0.5 μL，加水补足50 μL。PCR扩增条件为：98 ℃ 10 s，55 ℃ (同源臂)或50 ℃ (卡那盒) 15 s，72 ℃ 1 min (同源臂)或1.5 min (卡那盒)，30个循环，最后72 ℃ 5 min。PCR产物最后进行纯化，并测定核酸纯度和浓度，-20 ℃保存。

1.3 融合PCR扩增线性突变盒(含上、下游同源臂及卡那盒)

将上、下游同源臂及卡那盒模板等摩尔混合，以此混合产物为DNA模板，用上游同源臂的正向引物及下游同源臂的反向引物扩增，扩增含上游同源臂、卡那盒及下游同源臂的线性打靶突变盒。PCR扩增体系(50 μL)：5×PrimeSTAR^TMbuffer 10 μL、dNTP mixture (2.5 mmol/L) 4 μL、上下游同源臂及卡那盒模板(10 ng/μL) 2 μL、PrimeSTAR^TM HS DNA polymerase 0.5 μL，加水补足50 μL。PCR扩增条件为98 ℃ 10 s，58 ℃15 s，72 ℃ 3.5 min，30个循环，最后72 ℃ 5 min。PCR产物用QIAquick Gel Extration Kit (Qiagen)回收目的带进行纯化，并测定核酸纯度和浓度，–20 ℃保存。

1.4 感受态细胞的制备

将含pKD46质粒的鼠疫菌201株，接种于5 mL LB肉汤(Amp^R)中，26 ℃培养至OD₆₂₀为0.6-0.8左右，并加入终浓度为10 mmol/L L-阿拉伯糖诱导2 h，4 ℃ 4000 r/min离心5 min收集菌体，并用等体积灭菌去离子水洗涤2次，最后用1 mL 10%灭菌甘油悬浮均匀，分装成每管50 μL，于-70 ℃冻存以备用。

1.5 电转

取1-3 μg的PCR产物加入到感受态细胞并轻微混匀，置冰上放置15 min，将PCR产物和感受态细胞的混合物加入到预冷电击杯中，在25 μF200 Ω 1.8 kV的参数下电击，电击完后立即加入900 μL的无抗性LB培养基悬浮细胞，并将电击细胞转入到离心管中，于26 ℃培养2-4 h。短暂离心后，取200 μL悬浮物均匀涂布在含卡那抗性的LB平板上，26 ℃培养2-3 d。

1.6 重组克隆的PCR鉴定

挑取在LB平板生长的单克隆，转涂于另一块LB平板，26 ℃培养24 h后，刮取少量细菌，洗脱至100 μL无菌水中，于99 ℃变性10 min，取5 μL作为模板进行PCR鉴定。以野生株的DNA和水作为对照，用敲除基因的内部鉴定引物、外侧鉴定引物和卡那盒的内部鉴定引物交叉配对进行鉴定，若目的基因被卡那盒置换，则内部鉴定引物为阴性，而外侧鉴定引物和卡那盒的交叉鉴定引物则为阳性，说明目的基因成功敲除。

2 结果和分析 2.1 两步PCR介导的Red重组技术敲除鼠疫菌sRNA及染色体大片段的示意图

利用两步法PCR法构建含目的基因上下游同源臂(600-1000 bp)的线性抗性盒(图 1)。第一步PCR先扩增出目的基因上、下游同源臂(含与卡那盒末端同源的序列)及卡那抗性盒；第二步融合PCR以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩尔混合物为模板，以上游同源臂的上游引物(Up-F)及下游同源臂的下游引物(Down-R)进行3个片段的融合，获得含上下游同源臂及卡那盒的线性突变盒，经胶回收后再电转到含有pKD46质粒的鼠疫201菌株，PCR鉴定含卡那抗性的基因敲除株。

2.2 鼠疫菌sRNA RyhB缺失突变株的构建

2.2.1 PCR扩增目的基因的上、下游同源臂及卡那盒: RyhB1的上下游同源臂约为950 bp，RyhB2的上下游同源臂约为740 bp，卡那盒为1598 bp。PCR扩增的RyhB1的上下游同源臂的条带接近1000 bp，RyhB2的上下游同源臂的条带接近750 bp，卡那盒条带位于1500-2000 bp之间(图 2)，都与预期目的条带大小一致，说明成功扩增RyhB1和RyhB2的上下游同源臂及卡那盒。

2.2.2 融合PCR构建含上、下游同源臂的线性突变盒的鉴定: 将第一步PCR扩增的鼠疫菌sRNA RyhB1及RyhB2的上下游同源臂及卡那盒作为模板，通过融合PCR扩增卡那盒两端含上下游同源臂的线性突变盒，图 3结果显示PCR扩增的RyhB1和RyhB2的线性突变盒，大小介于3 kb附近，与目的条带大小一致，说明成功获得RyhB1和RyhB2的线性突变盒。

2.2.3 PCR鉴定鼠疫菌RyhB1及RyhB2缺失突变株: 传统的一步法突变技术使用的同源臂较短(一般为36-50 bp)，对小于200 bp sRNA的敲除比较困难。本研究以长度约为110 bp鼠疫菌sRNA RyhB1 (108 bp)和RyhB2 (106 bp)为例，通过融合PCR构建较长同源臂，提高了同源重组效率，成功构建了RyhB1和RyhB2的缺失突变株。当较长线性突变盒和RyhB1基因发生同源重组后，卡那盒取代了RyhB1基因(图 4-A)，因此可用RyhB1外侧鉴定的上游引物(RyhB1-I-F)和卡那盒鉴定的下游引物(K-R)配对，及用RyhB1外侧鉴定的下游引物(RyhB1-I-R)和卡那盒鉴定的上游引物(K-F)配对，PCR成功扩增出720 bp和765 bp条带与预期目的带一致；使用RyhB1内部引物(RyhB1-int-F/R)鉴定时，敲除株为阴性而阳性对照株能扩出目的带，以上结果说明成功构建RyhB1缺失突变株。
图 4-B结果表明：用RyhB2外侧鉴定引物(RyhB2-I-F/R)和卡那盒鉴定引物(K-F/R)交叉配对，成功扩增出842 bp和688 bp条带与预期目的带一致；应用RyhB2外侧鉴定引物(RyhB2-I-F/R)，若敲除不成功，目的基因未被卡那盒置换，则只扩增与野生株一样大小的579 bp片段；若敲除成功，卡那盒完全替换RyhB2，敲除株能扩增出2071 bp的片段，结果显示成功构建RyhB2缺失突变株。2.3 鼠疫菌染色体大片段缺失突变株构建

2.3.1 鼠疫菌47kb毒力大片段缺失突变株的鉴定: 通过融合PCR构建鼠疫菌小RNA RyhB2突变株时，由于设计的同源臂含有鼠疫菌全基因组转座子重复序列tnp_22，结果发生非特异性同源重组，将介于tnp_20和tnp_22转座子之间的47 kb大片段缺失。图 5结果表明：47 kb突变株tnp_20外侧鉴定引物rstA敲除株和野生株(见第1和2泳道)都为阳性，而内侧鉴定引物rhsA1、dalD、tpx和pspA敲除株(第4、7、10、13泳道)均为阴性，而各对内侧引物野生株(第5、8、11、14泳道)均为阳性，证实47 kb大片段成功敲除，而Deng等报道47 kb大片段缺失后LD50为1.5×10⁶ CFU，毒力较野生株(LD50为6 CFU)下降约10万倍，说明47 kb是鼠疫菌的一个毒力大片段^[20]。

2.3.2 鼠疫菌47 kb毒力大片段分段敲除策略: 47 kb是一个含40多个基因的毒力大片段，为确定导致47 kb减毒的主要基因，如采取单个基因逐个敲除的方法耗时而繁琐，若采用分段敲除技术及结合LD50试验的策略，则可简单、快速和高效确定47 kb大片段减毒的原因。如图 6所示：本研究将47 kb分为47-1 (13177 bp)、47-2 (10468 bp)和47-3 (21636 bp) 3个部分，而47-3又分为a(9168 bp)、b (6155 bp)及c (5892 bp) 3个片段，47-3c又分为若干个小片段。

2.3.3 鼠疫菌47kb大片段分段敲除株的PCR鉴定: 图 7-A结果表明：47-2的外侧鉴定引物hrpA，突变株和野生株都为阳性(见第1和2泳道)，内部鉴定引物dalD及IdhA1敲除株(第4及7泳道)均为阴性，而野生株(第5及8泳道)均为阳性，说明47-2成功敲除；类似的47-3的外侧鉴定引物为IdhA1，突变株和野生株都为阳性(见第1和2泳道)，内部鉴定引物tyrR及nifJ敲除株(第4及7泳道)均为阴性，而野生株(第5及8泳道)均为阳性，说明47-2成功敲除(图 7-B)；47-3a的外侧鉴定引物为YP-2127，突变株和野生株都为阳性(见第1和2泳道)，内部鉴定引物nifJ及aesS2敲除株(第4及7泳道)均为阴性，而野生株(第5及8泳道)均为阳性，说明47-3a成功敲除(图 7-C)；47-3b的外侧鉴定引物为tyrR，突变株和野生株都为阳性(见第1和2泳道)，内部鉴定引物soxR2及YP-2127敲除株(第4及7泳道)均为阴性，而野生株(第5及8泳道)均为阳性，说明47-3b成功敲除(图 7-D)；以上结果表明成功构建了47-2 (10.4 kb)、47-3 (21.6 kb)、47-3a (9.2 kb)及47-3b (6.1 kb)等大片段的敲除株。
3 讨论

一步法突变技术是一种快速和精确的基因突变方法，该方法所需的同源区短，不需构建打靶质粒，因此实验周期大大缩短，但有其局限性。在大肠杆菌中一步法突变技术使用较短同源臂(36-50 bp)，其同源重组效率具有菌株及基因的依赖性，即不同的菌株及同一菌株不同基因的同源重组效率可能存在差异，而增大同源臂是提高同源重组效率的有效手段。如一步法敲除技术在假结核耶尔森菌中的同源重组效率较低，需将同源臂提高到500 bp才能有效敲除int、recA和gmd-fcI等基因^[18]；在霍乱弧菌中，较短的同源臂(50 bp)只能将N16961型霍乱弧菌菌株的ctxB及toxT基因敲除，而使用1000 bp同源臂则可将4种不同菌株(N16961、SY10045、V080085及V080080) 中的ctxB、toxT、lacZ及recA等基因成功敲除^[17]。因此一步法突变技术有菌株依赖性，并不适用于其他细菌全基因组大片段的基因敲除。

随着鼠疫CO92和91001等菌株全基因组测序的完成，为鼠疫菌功能研究提供了非常有用的信息。鼠疫菌RyhB是一类新近发现的长约为110 bp非编码sRNA，在鼠疫菌基因组有RyhB1和RyhB2两个拷贝，可参与铁利用和储存相关基因转录的调控。一步法突变技术在鼠疫菌中的同源重组效率较大肠埃希菌低，特别是对小于200 bp的sRNA敲除较困难，RyhB虽经多次敲除均未成功，本研究通过融合PCR构建长同源臂(600-1000 bp)后，可成功敲除鼠疫菌RyhB1 (108 bp)、RyhB2 (106bp)、ssrS (382 bp)、ssrA (364 bp)等sRNA，最短可将36 bp的ssrS启动子区域缺失，此外，本方法也适合鼠疫菌超过2 kb的染色体大片段的敲除。在构建RyhB2突变株时，由于长同源臂包含全基因组一个转座子重复序列，意外获得47 kb缺失减毒株，通过采取分段敲除技术获得染色体大片段缺失株(大于2 kb)，包括47-2 (10.5 kb)、47-3 (21.6 kb)、47-3a (9.2 kb)、47-3b (6.2 kb)及YP_2132-2135 (3.4 kb)，并结合动物试验，发现TyrR突变株的毒力较野生株降低约1万倍，并构建TyrR突变株的回补株且回补株的毒力恢复，最终确定tyrR基因缺失是导致47 kb减毒最主要的基因^[20]。因此通过融合PCR法构建600-1000 bp的同源臂，可有效提高同源重组效率，特别适于鼠疫菌sRNA (36-200 bp)及染色体大片段(2-47 kb)的基因敲除，且操作简单、快速及高效，可应用于鼠疫菌全基因组的敲除。

当然，鼠疫菌同源重组效率除主要受到同源臂长度影响外，也跟PCR突变盒的纯度和浓度、感受态的状态、阿拉伯糖诱导的浓度和时间等多因素有关。因此在同源重组过程中，要求PCR扩增上下游同源臂及卡那盒时PCR产物特异性要好，融合的线性突变盒纯化后需切胶回收，且浓度一般为200-500 ng/μL，为提高电转效率，制备的鼠疫菌感受态细胞的OD₆₂₀一般为0.6-0.8，10 mmol/L阿拉伯糖要诱导2 h；为避免假阳性克隆，若使用质粒模板扩增抗性盒，最好使用Dpn I酶消化抗性盒以降解模板中质粒，或直接提取含抗性盒的敲除株染色体DNA作为模板。另外当同源臂含非特异性重复序列时，可能造成非必要同源重组，像本研究中的47 kb缺失突变株就是非特异重组一个极好的例证。因此要根据不同靶基因设计同源臂，避免同源臂含有靶基因本身或全基因组多个非特异性同源序列，造成靶基因的错误敲除。需要注意的是PCR在扩增长同源臂时使用普通Taq酶可能会出现点突变，如果同源臂包含ORF有可能会引起该基因的插入突变，因此扩增时尽可能使用具有校正功能的高保真酶。一般对缺失突变株鉴定方法包括PCR、DNA测序、构建互补株，此外还可利用Northern blot、Western blot、毒力及生理等表型试验来验证。PCR是常用的鉴定方法，为避免插入突变对基因功能的影响，也可构建缺失基因的互补株进行验证，若互补株不能有效回补敲除基因的表型或生理功能，则说明可能有插入突变。因此在构建缺失突变株时，要根据不同基因的生理或毒力功能，综合选用多种方法进行验证，以保证基因敲除结果的可靠性。总而言之，本研究基于Red重组系统构建的二步法突变技术，避免了传统的酶切、连接构建载体的过程，是一种简单、高效的精确修饰鼠疫菌sRNA及染色体大片段的方法，适合于鼠疫菌全基因组的基因敲除，为研究鼠疫菌sRNA调控及致病性研究提供有力的工具，也为其他微生物的功能研究提供科学依据和思路。