2017, Vol. 57中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 李小静, 江宝塔·穆哈德斯, 杨兰, 郑华军, 彭堂见, 张旭, 姜成英, 刘双江. 2017
- Xiaojing Li, Jiangbaota·Mahadesi, Lan Yang, Huajun Zheng, Tangjian Peng, Xu Zhang, Chengying Jiang, Shuangjiang Li. 2017
- 喜温嗜酸硫杆菌SM-1在不同温度下基因组的可塑性
- Genomic plasticity of Acidithiobacillus caldus SM-1 at different temperatures
- 微生物学报, 57(7): 1083-1094
- Acta Microbiologica Sinica, 57(7): 1083-1094
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文章历史
- 收稿日期：2016-10-31
- 修回日期：2016-12-09
- 网络出版日期：2017-02-14
引用本文 |
2. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237;
3. 中国科学院大学中丹学院, 北京 100190;
4. 上海人类基因组研究中心, 上海 201203;
5. 中南大学资源加工与生物工程学院, 湖南 长沙 410083
2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
3. Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China;
4. Chinese National Human Genome Center at Shanghai, Shanghai 201203, China;
5. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, Hunan Province, China
Shuangjiang Liu, Tel: +86-10-64807581; Fax: +86-10-64807421; E-mail: liusj@im.ac.cn
微生物冶金技术，是指利用微生物的氧化、还原等作用，用于将矿石中的有价金属浸取出来，例如从硫化物矿石中浸出铜、镍、钴等和从低品位铀矿石中浸出铀；也可用于脱除矿石中的有害杂质，例如含砷难处理金矿的微生物氧化预处理脱砷和高硫煤的微生物氧化脱硫等。与传统的物理或化学冶金技术相比，具有生产成本低、投资少、工艺流程短等优点[1]。微生物冶金技术中，堆浸法冶金的应用较为广泛[2]，然而容易受到外部环境条件的影响，例如芬兰、挪威等地，冬天时温度低至-30 ℃[3]，我国有三分之二的有色金属资源分布在西部尤其是青藏高原地区，其中玉龙铜矿的铜金属储量为3.8 Mt，但是常年的低温气候使得微生物浸矿的可行性减小。随着生长温度的降低，微生物的生长和代谢速率随之下降，严重影响生物冶金的速度和效率。
矿堆中的温度受多种条件限制，其中，矿堆规模、外界环境温度、内部放热反应等都影响其内部的温度。由于生物冶金过程是放热过程，有考察表明，矿堆内的温度随堆高呈梯度变化，内部温度最高可达50 ℃，但当外界环境温度较低时，矿堆表面温度的快速降低会使矿堆内部的温度降低至30-40 ℃，目前发现的能在30-40 ℃发挥最大冶矿效率的微生物较少。At. thiooxidans和At. caldus是专性硫氧化细菌，能够利用硫化矿物进行生长，但At. thiooxidans最适生长温度为25-30 ℃，而At.caldus最适生长温度为45 ℃，比At. thiooxidans更适用于矿物堆浸过程。作为主要的硫氧化细菌，对其进行低于最适温度的驯化，能够拓宽菌株的生长温度范围[4]，同时提高其在低于其最适温度时的冶金效率，促进工业冶金的进程。另外，探索冶金微生物在较低温度下适应性的特点也有助于应用在其他的低温菌株的改造中。
由于能减少自然进化中的不可控因素，实验室进化实验目前被广泛应用在各菌株的驯化以及基因型改变和表型变化的关系研究中[5-7]。低温驯化作为一种有效的手段，可以通过连续低温下的驯养，得到稳定的耐低温菌株，因此也被广泛应用在生物冶金过程中，例如：王清良等采用现场吸附尾液对嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)进行了低温驯化，使其能够更好地适应环境，并保持活性[8]。At. caldus SM-1是本实验室从生物反应器中分离得到的一株自养型细菌[9]，是生物冶金反应中一株重要的硫氧化细菌。转座原件以及质粒的存在是发生进化及新的表型产生的潜在动力。基因组分析发现，同其他菌株相比，SM-1具有较多的转座原件以及质粒数目。At. caldus ATCC51756基因组分析也发现含有较多的转座原件，这说明At. caldus的基因组具有较强的可塑性[10]。
目前文献报道的细菌对于低温的反应以及适应主要通过以下几种方式：(1) 改变蛋白质氨基酸残基的电荷状态。有研究表明在低温条件下，表面残基负电荷氨基酸增多，如谷氨酸、天冬氨酸比例增多，精氨酸和赖氨酸比例减少等。(2) 改变蛋白质本身结构，灵活小片段的增加、构型变化等被发现与低温生长相关[11-12]。(3) 促进蛋白、DNA以及RNA的正确折叠。Ferrer等在2003年的研究中通过引进1株嗜冷菌Oleispira Antarctica的伴侣蛋白Cpn60和Cpn10到大肠杆菌，证实了伴侣蛋白的活性是大肠杆菌在低温下生长的限速原因[13]。一些冷激蛋白(CSP)和冷诱导DEAD box RNA解旋酶能够在低温条件下防止mRNA的不正确折叠，从而维持低温下的转录起始[14]。(4) 改变脂肪酸的组成。细胞膜的流动性对于耐低温生长至关重要，脂肪酸的组成对于膜的流动性影响较大。已有的研究发现，低温条件下，细胞通过改变不饱和脂肪酸含量适应环境，不饱和脂肪酸越多，膜的流动性越好，有利于维持细胞的生命活动[15]。(5) 合成保护性溶质。细胞在应对极端生长条件时，通过累积一些亲水性的物质，例如糖、胺类物质、氨基酸、无机离子等维持细胞内部的稳态[16]。保护性溶质的累积主要通过2种方式：体内合成和体外摄取。当外界环境中缺乏保护性溶质时，只能通过自身的合成累积。海藻糖是普遍的应对低温条件的保护性溶质，主要的作用是作为膜和蛋白的稳定剂和保护剂，在高渗、超氧化物自由基以及高温条件下也可以发挥作用[17]。
由于对冶金微生物的低温驯化和冷适应机理的研究相对较少，本研究选择At. caldus SM-1进行了低温驯化，通过重测序手段，比较驯化前后的基因组改变，发现基因组中单核苷酸位点的突变，对包含位点变化的基因从功能上进行分类，分析可能与温度适应性相关的基因，认知SM-1冷适应机制的基因基础。
1 材料和方法 1.1 所用菌株以及培养条件Acidithiobacillus caldus SM-1是本实验室从生物反应器中分离得到的1株细菌，其最适生长温度为45 ℃，最适生长pH为2.5；用BSM (basal salts medium)培养基加入单质硫粉进行培养。
培养基配方如下(g/L)：(NH4) 2SO4 3.0，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.1，Ca (NO3) 2·2H2O 0.01，pH 2.5，用1:1硫酸调至pH 2.5，加入过滤的微量元素液。接种前加入单质硫(S0)，硫粉采用常压间歇式灭菌法，每天灭菌1 h连续灭菌3 d[18]。
1.2 SM-1菌株在不同温度下的进化培养以下2组实验所用菌株，为同一菌株进化而来。
1.2.1 45℃培养实验: 将菌株从甘油管中接种到新的100 mL BSM加硫粉培养基中，所用三角瓶容量是250 mL，培养至细胞数目为107，再将其以10倍的稀释倍数转接到新的100 mL BSM培养基中，在45 ℃条件下培养。将其定义为野生型W45。 1.2.2 低于最适温度(37、40 ℃)驯化实验: 将菌株从甘油管中接种到新的100 mL BSM培养基中，所用三角瓶容量是250 mL，培养至细胞数目为107 (约5d)，之后再将其转接到新的BSM培养基中，分别在37、40 ℃条件下培养，连续转接932代。将在37 ℃培养的菌株定义为L37，40 ℃培养的菌株定义为M40。以上实验均设置3个平行。1.3 不同温度培养菌株较低温适应能力的检测首先将在37、40、45 ℃连续传代培养的各菌株分别以10倍稀释浓度转接到新的100 mL BSM培养基中，培养至对数生长期，以便消除转接初期造成的误差。之后，将菌体低速离心4000 r/min，浓缩，分别将各菌株转接至加有2 mL BSM及10 mmol/L连四硫酸钾的100孔培养板中，使初始OD值约为0.1，置于Bioscreen自动生长曲线测定仪、在37 ℃低速振荡培养。每个样品设置6组重复，以不加菌液的培养基作为对照。随着菌株的生长，每隔3 h测定OD 600，连续测定36 h。
1.4 扫描电子显微镜观察细胞表面形态收集处于生长对数后期的细胞，用浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液(PBS)清洗细胞，然后用2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定过夜后，乙醇梯度脱水，二氧化碳临界点干燥，喷金。利用扫描电子显微镜(SU8010，Hitachi，Japan)观察细胞大小和表面形态，每个样品用软件Nano measure从得到的扫描图像中选取3个不同区域，每个区域选取30个细胞进行长度测量及分组，组间距为0.4 μm，记录细胞长度的分布情况，统计每个区域不同大小细胞在选取的总细胞数中所占比率R (R =各组内细胞数/总细胞数)。
1.5 基因组提取选择在3个温度下驯化24个月和48个月的菌株，用台式高速冷冻离心机(AllegraTM 64R，BECKMAN-COULTER)离心(4 ℃，12000 r/min，10 min)收集处于对数生长后期的菌体，将各温度下平行生长的菌体分别混合，加无菌BSM培养基洗涤菌体。利用酚-氯仿法进行基因组提取[19]。
1.6 基因组重测序以及初始数据处理对提取获得的DNA样品(共6个)通过高通量焦磷酸测序技术(454 GS FLX)进行测序。经过质控的基因序列分别与参考基因组Acidithiobacillus caldus SM-1 (NC_015850.1) 序列进行比对，所用软件是454 GS Reference Mapper (version 2.3)。每一个比对结果生成一个“454HCDiffs.txt”文件，文件中包含有比对出的高可信度突变列表。将SNPs和Indels从“454HCDiffs.txt”中以高可信度进行提取。应控制每个位点突变所占比率大于10%，且至少在3个reads中出现。
1.7 基因组数据统计和筛选将得到的基因组重测序数据进行统计，分别统计基因间及基因内的单核苷酸突变。比较37、40 ℃驯化株与45 ℃野生株中发生基因位点突变的异同；进一步统计非同义突变位点，并对发生氨基酸变化的蛋白的功能进行分析。
1.8 预测及注释所用软件(1) tRNA预测：tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)。
(2) rRNA基因预测：RNAmmer (http://www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/)。
(3) 启动子区域预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/。
所用参考基因序列来自NCBI，蛋白序列从Uniprot (http://www.uniprot.org/)网站获得。
2 结果和分析 2.1 SM-1菌株在不同温度下培养驯化结果 2.1.1 不同温度下培养菌株在较低温度下的生长实验: 经过2年(约932代)长期驯化，获得了在低于最适生长温度下具有较高生长活力的菌株，如图 1所示，将较低温驯化菌株与野生株在37 ℃培养时，驯化菌株L37表现出更好的生长活性，3株菌L37、M40和W45分别在18、21和24 h达到最大OD值0.2930、0.2257和0.2345，菌株L37相较于野生株W45，其最高OD值增加了20%；在37 ℃条件下生长时，L37生长最快，3株菌的生长代时分别为14.3、19.5、22.7 h，相比于W45，L37的代时缩短37%。
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| 图 1 菌株L37、M40及W45在37 ℃时的生长曲线 Figure 1 Growth curve of three strains L37, M40 and W45 under 37 ℃. The x-axis represents time, the y-axis represents the absorbance value on 600 nm wave length. |
2.1.2 不同温度下培养菌株的菌体形态变化：扫: 描电镜观察发现，不同温度长期驯化的细胞表面没有发生明显变化，但是菌体长度具有差异，如图 2所示。较低温驯化株L37和M40培养的菌体平均长度分别为1.457 μm和1.315 μm，均小于W45的菌体长度1.759 μm。
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| 图 2 L37、M40及W45菌体长度分布图 Figure 2 The length distribution of different strains, W45, M40 and L37, separately. The x-axis represents the length and group distance (μm), the y-axis represents frequency of cells. |
2.2 不同温度下培养菌株的基因组突变 2.2.1 基因组单核苷酸位点突变: 环境对基因型的改变具有选择作用，当长期处于某一特定压力条件下时有益于突变累积，因此我们只选择在2次测序中都发生突变，且在群体中所占比例相同或者上升的单核苷酸位点进行分析，发生突变的位点见表 1。从表 1中可以看到，经过筛选后，菌株L37、M40、W45分别有418个、384个和347个核苷酸位点突变为2次测序的累积结果。对以上累积的突变位点进一步分析发现：L37中发生86个非同义突变，共分布在27个不同的基因中。M40中发生140个非同义突变，共分布在24个不同的基因中。W45中发生143个非同义突变，共分布在29个不同的基因中。
| Strains | SNPs (1) | SNPs (+) | Non-synonymous SNPs | Synonymous SNPs | Intergenic SNPs | Genes effected |
| L37 | 675 | 418 | 86 | 164 | 168 | 27 |
| M40 | 931 | 384 | 140 | 84 | 160 | 24 |
| W45 | 764 | 347 | 143 | 79 | 125 | 29 |
| SNPs (1) : The SNPs that are same in both sequencing; SNPs (+): The SNPs have the same or increasing ratio in second sequencing. Geneeffected: the genes containing the non-synonymous mutations among SNPs (+). | ||||||
2.2.2 突变基因的功能分析: 对上述不同温度培养菌株中发生突变的基因进行统计分析(图 3)，结果表明3个菌株共有的突变基因有11个(表 2)，2个低温驯化菌株的共有突变基因有3个(表 3)。3个不同温度培养的菌株也发生了各自的特异突变，W45菌株在无温度变化下生长进化，9个基因发生了特异突变，L37和M40基因组中，分别有9个和5个基因发生特异突变。
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| 图 3 L37、M40、W45共有和各自特有的突变基因的数目 Figure 3 The common or specific genes in three strains L37, M40 and W45. |
| SNP location | Locus_tag | Ref codon | SNP codon | Annotation |
| 134030 | Atc_0128 | GAG- > E | GAT- > D | Transposase, IS5 family |
| 134067 | Atc_0128 | AAG- > K | CAG- > Q | Transposase, IS5 family |
| 134235 | Atc_0128 | GCG- > A | ACG- > T | Transposase, IS5 family |
| 134236 | Atc_0128 | GCG- > A | GTG- > V | Transposase, IS5 family |
| 221715 | Atc_0212 | CAC- > H | TAC- > Y | Hypothetical protein |
| 892576 | Atc_0891 | ACC- > T | ATC- > I | EmrB/QacA subfamily drug resistance transporter |
| 1243282 | Atc_1228 | ATC- > I | AGC- > S | DNA methylase |
| 1243284 | Atc_1228 | GAC- > D | GAA- > E | DNA methylase |
| 1244732 | Atc_1229 | CGG- > R | CCG- > P | Acyltransferase 3 |
| 1868188 | Atc_1809 | GAC- > D | GCC- > A | ArsR family transcriptional regulator |
| 1876954 | Atc_1818 | AGA- > R | AGC- > S | Hypothetical protein |
| 1876979 | Atc_1818 | ACC- > T | AGC- > S | Hypothetical protein |
| 1876993 | Atc_1818 | GAC- > D | GAG- > E | Hypothetical protein |
| 1876997 | Atc_1818 | GCC- > A | GGC- > G | Hypothetical protein |
| 1877005 | Atc_1818 | GAG- > E | GAC- > D | Hypothetical protein |
| 1877007 | Atc_1818 | GAG- > E | AAG- > K | Hypothetical protein |
| 1877014 | Atc_1818 | CAC- > H | CAG- > Q | Hypothetical protein |
| 1877027 | Atc_1818 | CCC- > P | CAC- > H | Hypothetical protein |
| - | Atc_1953 | - | - | Integrase catalytic subunit |
| 2128813 | Atc_2081 | GTC- > V | GCC- > A | Transposase |
| 2164690 | Atc_2120 | AGG- > R | AAG- > K | Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit beta |
| 2583814 | Atc_2529 | ATC- > I | ATG- > M | Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic) subunit beta |
| 2584107 | Atc_2529 | GCC- > A | ACC- > T | Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic) subunit beta |
| 2584224 | Atc_2529 | ATC- > I | GTC- > V | Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic) subunit beta |
| -: Represents that protein Atc_1953 in strains L37, M40 and W45 all contained SNPs, but the SNP locations were not same, the detailswere not listed in table 2. | ||||
| SNP location | Locus_tag | Ref | Var | Ref codon | SNP codon | Annotation |
| 1021513 | Atc_1031 | A | G | ATC- > I | GTC- > V | ISAtfe-like protein |
| 1021515 | Atc_1031 | C | G | ATC- > I | ATG- > M | ISAtfe-like protein |
| 1135823 | Atc_1130 | A | G | TAG- > * | CAG- > Q | Hypothetical protein |
| 1135886 | Atc_1130 | T | A | ATG- > M | TTG- > L | Hypothetical protein |
| 1136027 | Atc_1130 | T | C | ACC- > T | GCC- > A | Hypothetical protein |
| 1665500 | Atc_1623 | A | C | TTT- > F | TTG- > L | Integrase catalytic subunit |
| *: represents stop codon. | ||||||
对3个菌株共有的11个突变基因编码蛋白的功能分析表明，这些蛋白主要涉及重金属抗性和毒性抗性(Atc_0891，Atc_1809)，负责毒性物质的外排和抗性基因的转录调节；DNA甲基化与蛋白乙酰化相关蛋白(Atc_1228，Atc_1229)，与基因组的结构稳定性和基因调控密切相关；另外2个功能蛋白(Atc_2120，Atc_2529) 与核苷酸代谢相关，参与细菌基本生命活动，控制细胞生长。其他基因编码转座酶(Atc_0128，Atc_2081)，整合酶催化亚基(Atc_1593) 和假想蛋白(Atc_0212，Atc_1818)。L37与M40经过长期较低温度驯化，发生了3个共有的基因突变(表 3)，其中atc _1031与atc _1623编码转座相关的蛋白，M_1130注释为假想蛋白，序列比对分析发现其在同属微生物中均为假想蛋白，与Pseudoalteromonas属细菌的外膜蛋白组装因子BamB具有约23%的同源性，与Gallaecimonas xiamenensis的二硫键形成蛋白B具有35%的同源性，该蛋白的功能需进一步验证。除共有的基因突变外，低温驯化菌株L37中有2个特有的功能基因发生改变(表 4)，1个基因编码DNA gyrase subunit B蛋白(Atc_0004)，该蛋白是依赖于ATP的拓扑异构酶类，通过使DNA形成负超螺旋的形式，调节和稳定DNA的拓扑结构，利于双链的解旋、DNA复制、重组和修复，其表达量被认为与低温的适应性相关[20]。研究表明，DNA结构中负超螺旋的增多能提高冷诱导蛋白的转录水平，应对冷环境[21]。
| SNP location | Locus_tag | Ref | Var | Ref. codon | SNP codon | Annotation |
| 5168 | Atc_0004 | A | G | ATC- > I | GTC- > V | DNA gyrase subunit B |
| 5170 | Atc_0004 | C | G | ATC- > I | ATG- > M | DNA gyrase subunit B |
| 5348 | Atc_0004 | G | A | GTC- > V | ATC- > I | DNA gyrase subunit B |
| 929355 | Atc_0932 | C | G | ACC- > T | AGC- > S | Carboxysome shell protein CsoS1 |
另一个基因编码羧酶体壳蛋白carboxysomeshell protein CsoS1 (Atc_0932)，该蛋白在蓝藻细菌或化能自养型细菌的二氧化碳固定中发挥作用。喜温嗜酸硫杆菌是一株利用二氧化碳作为碳源生长的化能无机自养微生物，二氧化碳的固定速率与细胞的生长直接相关[22]。M40菌株的基因组中，也发生了2个特有的功能基因突变(表 5)。atc_ 1096编码ATP-dependent RNA helicase，属于DEAD/DEAH box family蛋白，该家族蛋白酶为低温调节酶，在细菌中，能够与冷诱导蛋白Csp联合作用维持mRNA的正确结构[14]；其在植物应答温度变化，盐胁迫，渗透胁迫等过程中也起重要作用[23]。有研究发现一株耐冷硫氧化细菌Sulfuricella denitrificans skB26中DEAD/DEAH box RNA helicases的低温表达量明显升高[24]。同样，突变缺失DEAD/DEAH RAN helicases酶的Caulobacter crescentus 菌株在低温15 ℃条件下比野生菌株需要更长的生长周期[25]。这些发现表明，DEAD/DEAH box RNA helicases在低于最适温度的适应过程中发挥重要作用。另一个基因atc _1562编码酰基转移酶acyltransferase，经低温驯化后，基因组的1605242位置突变为终止密码子，酰基转移酶可以调节蛋白的活性及稳定性，该酶低温失活的作用需进一步验证。
| SNP location | Locus_tag | Ref | Var | Ref codon | SNP codon | Annotation |
| 1098841 | Atc_1096 | G | T | CGT- > R | CTT- > L | ATP-dependent RNA helicase |
| 1098843 | Atc_1096 | G | A | GCC- > A | ACC- > T | ATP-dependent RNA helicase |
| 1605242 | Atc_1562 | G | T | GAA- > E | TAA- > * | Acyltransferase |
| *: represents stop codon. |
2.3 氨基酸组成变化
基因组重测序结果发现，单核苷酸发生突变后，基因组编码的氨基酸数量发生改变。如图 4所示，L37和M40的谷氨酸Glu减少，而W45的谷氨酸数量不变，谷氨酸Glu属于带负电荷氨基酸，且侧链较长，在低温条件下，谷氨酸的减少往往伴随着Asp的增加，这种替换可能会最优化蛋白的特性[26]。本研究中，虽然Glu在L37及M40中均有减少，但Asp数量只在M40中增加。
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| 图 4 不同温度菌株中氨基酸数量的变化 Figure 4 The changes of amino acids composition in different strains. The capital letters in x-axis represent the abbreviation of amino acid, the y-axis represents the variation numbers of amino acids. A: alanine; C: cysteine; D: aspartate; E: glutamate; F: phenylalanine; G: glycine; H: histidine; I: isoleucine; K: lysine; L: leucine; M: methionine; N: asparagine; P: proline; Q: glutamine; R: arginine; S: serine; T: threonine; V: valine; W: tryptophan; Y: tyrosine. |
在低温菌株M40中苯丙氨酸Phe数量较W45中减少，Phe属于带苯环的氨基酸，能和正电荷氨基酸结合，稳定蛋白的三维结构。苯环的结构容易形成疏水的内核，而在低温条件下更倾向于亲水性的内核，因此Phe的减少可能有助于疏水内核减少[26]。较低温菌株L37中甘氨酸Gly和丝氨酸Ser数量明显增加，而M40和W45中变化较小。甘氨酸Gly和丝氨酸Ser的增加有利于增加较低温下蛋白的柔韧性，维持亲和力。L37和M40菌株的精氨酸数量减少而赖氨酸数量增多，有研究表明，碱性氨基酸中精氨酸较赖氨酸具有相对强的稳定性和疏水性，在低温适应性脂酶中也发现定性氨基酸例如精氨酸等的减少，可能有利于形成灵活的三级结构[27]。重测序结果分析还发现，甲硫氨酸和缬氨酸在L37和M40中均明显增多，但原因不明，需进一步确定。
3 讨论喜温嗜酸硫杆菌是生物冶金过程中重要的菌种，菌株SM-1是本实验室前期从生物冶金反应器分离获得的，最适生长温度为45 ℃[28]，在30-40 ℃下生长缓慢，冶金效率降低，因此限制了其在生物冶金中的应用。为了增强菌株在30-40 ℃浸矿的效果，通过长期在37、40 ℃驯化SM-1菌株，获得了适应在低于最适生长温度下生长的菌株。进一步通过罗氏454测序技术对其基因组进行重测序分析，发现了菌株L37、M40和W45在不同温度下基因组的改变。基因组重测序分析发现，在不同温度下，3株菌均发生了大量位点突变，且这些突变位点中，有许多是相同的，说明菌株的基因组可塑性较强。
经过2年驯化，3种温度(37、40和45 ℃)下都发生突变的基因主要涉及3方面的功能。(1) 抗性基因，包括砷抗性相关蛋白和毒性物质外排系统。在复杂的冶金环境中，重金属以及其他有毒物质的胁迫不可避免，对SM-1以及同属中其他菌种的基因组分析表明，Acidithiobacillus属具有较多的重金属抗性相关基因和毒性物质外排基因[29-30]，这说明基因组的构成与环境息息相关，本研究中抗性基因中的多个突变可能暗示这些基因在菌株对温度的适应过程中也起作用。ArsR family transcriptional regulator (Atc_1809) 作为砷抗性基因操纵子的转录抑制因子，通过与金属离子结合，调节一些与金属离子排出相关蛋白的转录，本研究中位于该基因的位点突变发生在377位，通过NCBI比对，该位点距离保守区域6个碱基。EmrB/QacA subfamily drug resistance transporter (Atc_0891) 是一个毒性物质转运蛋白，能够将胞内的有毒物质排出体外，介导跨膜转运过程，曾有研究表明在乳酸杆菌中，具有类似功能的蛋白Ir1584能促进乳酸杆菌在胆汁中重新开始生长，该结果表明，转运蛋白在抗压环境中有利于细胞的生存，本研究中该蛋白的1337位发生突变，氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸(T466I)。这些结果启示我们探究毒性抗性系统在其他的压力环境下的作用。(2) 基因调控相关基因。SM-1基因组中，分别编码DNA甲基化酶和蛋白酰基转移酶的基因atc _1228，atc _1229发生突变；DNA甲基化酶甲基化程度的强弱可以控制基因的表达水平，有文献报道，在面对胁迫的植物中，DNA甲基化水平明显下调，更利于抗胁迫蛋白的表达从而适应环境。蛋白酰基转移酶的主要作用是催化蛋白质的酰基化和去酰基化，能够同DNA甲基化过程共同调节某些抗胁迫基因的表达以应对环境压力。(3) 与核酸代谢相关的基因。ribonucleotide-diphosphate reductase subunit beta和ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic) subunit beta同属于核苷酸磷酸还原酶亚基，催化脱氧核苷二磷酸形成，与核苷酸代谢相关。有研究表明，该酶提供必需的前体物质，在DNA的修复中也具有重要作用，核苷酸还原酶通过参与到细菌的基本生命代谢中，控制细胞的生长、分裂和繁殖，在环境胁迫下，直接调节DNA的合成速率，影响细胞的生长和繁殖。突变发生在DNA合成的限速酶上，其对于环境胁迫的适应性值得进一步分析和验证。
功能缺失也是基因组进化的选择之一[31]，较低温驯化菌株M40中编码酰基转移酶的基因atc _1562在基因组1605242位点突变为终止密码子，推测该蛋白的功能在长期较低温驯化下缺失。
在较低温37 ℃和40 ℃驯化下，各自所特有的突变基因涉及能量代谢以及DNA/RNA解旋作用等。细菌在压力条件下需要更多的能量提供给DNA修复系统，因此能量的产生与环境适应性密切相关[32]，在L37菌株中，编码羧酶体壳蛋白(carboxysome shell protein CsoS1) 的基因atc _0932在929355位点发生突变。核酸结构的稳定性控制蛋白的表达，已有研究证实，DNA旋转酶及RNA解旋酶在细菌低温生存过程中发挥作用[20, 24]，在L37及M40中，编码DNA旋转酶的基因atc_ 0004[24]及编码RNA解旋酶的基因atc_ 1096分别发生突变。
较低温驯化的两个菌株L37和M40中3个分别编码转座酶、整合酶和假想蛋白的基因发生突变。由于这些突变只存在于较低温条件下，推测其可能与菌体适应较低温度相关。但蛋白的具体功能和位点突变造成的影响仍需实验验证。
本研究对于较低温度适应性的研究是从单核苷酸的突变出发，比较发现，发生位点变化的功能基因在文献报道的对其他细菌的转录研究中，处于低温条件时，具有不同的表达水平，这暗示硫代谢细菌可能具有与其他细菌相同的普遍的低温适应机制，同时假想蛋白编码基因的突变，又提示生物冶金微生物也具有特定的较低温适应机制。
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