中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
文章信息
- 牟宏芳, 马旭升, 罗志宽, 张坚, 郑海学. 2017
- Hongfang Mou, Xusheng Ma, Zhikuan Luo, Jian Zhang, Haixue Zheng. 2017
- 口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活
- Structural protein VP0 of foot-and-mouth disease virus inhibits type Ⅰ interferon signaling pathway
- 微生物学报, 57(7): 994-1003
- Acta Microbiologica Sinica, 57(7): 994-1003
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文章历史
- 收稿日期:2016-09-20
- 修回日期:2016-12-06
- 网络出版日期:2016-12-27
2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 家畜疫病病原生物学国家重点实验室, 国家口蹄疫参考实验室, 甘肃 兰州 730046
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu Province, China
Haixue Zheng, Tel:+86-931-8342086, E-mail:haixuezheng@163.com
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性传染病,能造成严重的经济损失和社会影响。病毒衣壳呈正二十面体结构[1],该病毒已发现7个血清型:A型、O型、C型、Asial型、SAT1型、SAT2型和SAT3型,各个血清型又有多个亚型,各血清型之间无交叉保护现象。口蹄疫病毒的RNA由8500个核苷酸组成,编码一个大的多聚蛋白复合体,该复合体由自身编码的蛋白酶(L、3C)及少数宿主因子裂解后形成多个前体蛋白,并最终裂解为成熟的8个非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)和3个结构蛋白VP0、VP1和VP3[2]。VP0蛋白作为FMDV衣壳蛋白被蛋白酶3C进一步裂解为VP4蛋白和VP2蛋白。
FMDV属于小RNA病毒科,在感染宿主细胞的过程中,能够诱导天然免疫应答的产生。干扰素(interferons,IFNs)和干扰素诱导的细胞抗病毒反应是机体对抗病毒感染的初级防御体系。病毒在感染和复制的过程中产生一些病毒特有的保守结构,称为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),PAMPs能够被模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别,激活干扰素的产生[3]。视黄酸诱导基因I (retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)和黑色素瘤分化基因5 (melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5) 可识别细胞内不同的病毒RNA,是抗病毒天然免疫信号通路中重要的模式识别受体[4],在感染病毒后被刺激活化的受体招募下游接头蛋白VISA和MITA,去激活下游的IκB激酶使干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor-3,IRF3) 和NF-κB活化,磷酸化的IRF3和NF-κB进入细胞核中,直接诱导干扰素基因表达[5]。
FMDV在感染初期能逃避宿主免疫,从而高效迅速地复制。FMDV可通过破坏天然免疫中关键蛋白分子的转录和表达进而促进病毒蛋白的合成[6-7]。文献报道,FMDV Lpro可裂解宿主细胞中eIF4G分子以阻断宿主蛋白的合成,来抑制干扰素的产生[8]。FMDV 3C蛋白可通过切割NEMO从而影响干扰素等抗病毒分子的产生[9]。FMDV VP1蛋白通过与sorcin蛋白相互作用抑制干扰素的产生[10]。VP0蛋白是FMDV的主要结构蛋白,在3C蛋白酶的作用下裂解成VP2蛋白和VP4蛋白。VP2蛋白上存在细胞表位,有一定的免疫活性。VP4蛋白位于衣壳的内表面并且与病毒的RNA结合,是决定病毒抗原性的主要成分,发挥着重要的免疫原性作用[11]。同时,VP4蛋白也是宿主识别病毒的主要位点,在病毒的黏附和入侵方面具有重要的作用。但VP0蛋白在细胞中的作用机理仍不清楚,我们将通过试验探索VP0蛋白对干扰素信号通路的影响机制。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞与病毒: HEK-293T细胞购自中国科学院上海细胞库,毒株FMDV/O/Mya98/2010、仙台病毒(Sendai virus,SeV)和仓鼠肾细胞系(BHK)由本实验室保存。 1.1.2 主要试剂: Trizol试剂、反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂(RRI)、Oligo (dT)引物、随机引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、LA Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ、T4 DNA连接酶、大肠杆菌Trans5α感受态、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和蛋白预染Marker均购于宝生物工程大连有限公司;质粒DNA提取试剂盒与胶回收纯化盒子购于OMEGA公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司;鼠抗HA单抗、鼠抗Flag单抗、鼠抗β-actin单抗、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗购于Santa Cruz公司;LipofectamineTM 3000转染试剂购于Invitrogen公司;Opti-MEM、0.25% EDTA胰酶、新生牛血清(FBS)和DMEM HIGH GLUCOSE细胞培养液购于Gibco BRL公司;Tween 20、甲醛溶液、蛋白酶抑制剂、30%聚丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇和琼脂粉购于罗氏公司。1.2 真核重组质粒的构建参照NCBI上FMDV/O/Mya98/2010序列(登录号:JN998085.1) 用软件Primer Premier5设计扩增引物,分别引入酶切位点EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ。上游引物:5′-ATGGGAGCGAATTCATGATCGCG-3′;下游引物:5′-GGAAGATCTTCACTTGTCATCATCG-3′。
FMDV感染BHK细胞后,用Trizol法提取病毒液总RNA,反转录得到cDNA,以此为模板PCR扩增目的片段,将扩增产物克隆于pCAGGs载体上,双酶切鉴定,送测序获得阳性重组质粒pCAGGs-VP0。
1.3 Western blotting检测将HEK-293T细胞铺于细胞皿中,待细胞至70%-90%时,按照LipofectamineTM 3000说明书进行转染。实验分为两组,空载体组(pCAGGs)和重组质粒组(pCAGGs-VP0),转染48 h后收样,处理样品,加入1×SDS蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE,转移至NC膜上,用5%的脱脂奶粉封闭2 h,以抗Flag标签的鼠抗(1:1000) 4 ℃孵育过夜,用山羊抗鼠HRP-IgG (1:5000) 的二抗,室温孵育2 h,用ECL化学发光液显色曝光。
1.4 总RNA的提取及荧光定量PCR检测将HEK-293T细胞铺于60 mm细胞皿中,设空载体组、空载体SeV刺激组、pCAGGs-VP0重组质粒组、pCAGGs-VP0重组质粒SeV刺激组,用LipofectamineTM 3000转染24 h后,用SeV刺激8 h,收获细胞后,按照Trizol法提取RNA,反转录为cDNA,按照以下体系:10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,8.2 μL DEPC水和1 μL cDNA,进行荧光定量PCR,分别检测干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β以及下游刺激基因ISG15、ISG20的mRNA表达变化(检测引物如表 1)。反应程序如下:95 ℃变性3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,40个循环;溶解曲线分析。
Primers | Sequence of primer (5′→3′) |
IFN-β-forward | TTGTTGAGAACCTCCTGGCT |
IFN-β-reverse | TGACTATGGTCCAGGCACAG |
RIG-I-forward | CACCTCAGTTGCTGATGAAGGC |
RIG-I-reverse | GTCAGAAGGAAGCACTTGCTACC |
ISG20-forward | CCGTGGCCAGGCTAGAGAT |
ISG20-reverse | CCGCTCATGTCCTCTTTCAGT |
IRF3-forward | TCTGCCCTCAACCGCAAAGAAG |
IRF3-reverse | TACTGCCTCCACCATTGGTGTC |
Human-GAPDH-forward | GAGTCAACGGATTTGGTCGT |
Human-GAPDH-reverse | GACAAGCTTCCCGTTCTCAG |
FMDV-forward | ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA |
FMDV-reverse | GCGAGTCCTGCCACGGA |
Mouse-GAPDH-forward | CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA |
Mouse-GAPDH-reverse | GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC |
将BHK细胞铺于细胞皿中,分别转染空载体和pCAGGs-VP0对照组以及空载体和pCAGGs-VP0接毒组,分别于0、2、4、6、8、10 h收样品。Trizol法提取RNA后,反转录获得cDNA,反应体系和程序同上,荧光定量PCR检测FMDV的复制情况(检测引物如表 1)。
1.5 双荧光素酶报告基因检测将HEK-293T细胞铺至24孔板,待细胞长至60%-80%后,按照LipofectamineTM 3000操作说明书进行转染,分别设置空载体组、pCAGGs-VP0重组质粒剂量依赖(50、100和200 ng)对照组以及SeV刺激组,转染24 h后,用SeV刺激12 h后,按照双荧光素酶报告系统试剂盒说明书进行检测。
VP0蛋白分别与RIG-I、MDA5、VISA、TBK1、IRF3和IRF7等RLRs信号通路分子共转染作为试验组;空载体分别与信号通路分子共转染作为对照组。26 h后收样检测,转染和检测方法同上。
1.6 免疫共沉淀将HEK-293T铺于60 mm细胞皿,待细胞至80%-90%时,按照LipofectamineTM 3000说明书进行转染。实验分为实验组和对照组,转染36 h后收样裂解,裂解产物分为两部分:一部分作为总蛋白样品input;另一部分加入抗Flag标签的一抗或非特异性IgG,分别和蛋白A/G琼脂糖珠4 ℃过夜,用裂解液将过夜后的免疫共沉淀复合物洗3次后,加入1×SDS蛋白上样缓冲液煮沸样品,然后进行Western blotting分析。
1.7 数据分析用2-△△Ct相对定量分析方法计算基因的相对表达量,所有数据用SPSS Statistics18.0进行统计分析。采用单因素方差分析法,P < 0.05差异有统计学意义。
2 结果和分析 2.1 pCAGGs-VP0重组表达载体的酶切鉴定将重组表达质粒pCAGGs-VP0用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后,可见900 bp左右的VP0条带和5000 bp左右的载体条带(图 1)。经测序后进一步证明重组表达质粒构建成功。
2.2 VP0蛋白在HEK-293T细胞中的表达
将重组质粒pCAGGs-VP0转染HEK-293T细胞,48 h后收样处理进行Western blotting检测,结果如图 2,VP0蛋白在34.4 kDa处有特异性条带,而空载体对照组未见相应的条带,证明VP0可以在细胞中正常表达。
2.3 VP0蛋白对FMDV复制的影响
为了确定VP0蛋白是否对FMDV复制有影响,pCAGGs-VP0质粒转染BHK细胞后,FMDV感染细胞,不同时间点收集感染后的细胞并提取总RNA,Real time RT-PCR方法检测FMDV在BHK细胞中的复制情况。结果如图 3,第0-2小时试验组与对照组FMDV复制差异不显著(P > 0.05),4-6 h试验组中FMDV复制水平显著高于对照组(P < 0.05),6 h后试验组FMDV复制水平较对照组差异极显著(P < 0.01)。
2.4 VP0蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路的活化
干扰素能够抑制病毒的复制,为了确定VP0蛋白是否可以通过抑制干扰素的产生进而促进病毒复制,通过双荧光素酶报告基因系统检测VP0蛋白在不同剂量条件下对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子的影响。结果如图 4所示,分别转染pCAGGs和pCAGGs-VP0 50、100和200 ng后,随着VP0剂量的增加,VP0蛋白可显著抑制SeV诱导的IFN-β的产生和NF-κB的活性且具有剂量依赖性(P < 0.01)。
图 4表明,VP0蛋白能够抑制I-IFN的产生。为了确定VP0蛋白在I-IFN产生通路中的作用节点,将VP0分别与RLRs信号通路分子共转后,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测。结果如图 5,VP0蛋白分别抑制RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3等信号通路分子诱导的IFN-β的产生(P < 0.05),对IRF7诱导的IFN-β的产生没有显著影响。
2.5 VP0蛋白抑制I-IFN通路基因及其下游刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的转录
Real-time RT-PCR检测VP0蛋白对SeV诱导的I-IFN及其下游ISGs的影响,结果如图 6所示。VP0转染组经SeV诱导后,干扰素通路基因RIG-I、IRF3、IFN-β以及干扰素刺激基因ISG15、ISG20的相对表达量显著低于空载体的SeV处理组(P < 0.01或P < 0.05)。说明FMDV VP0蛋白可明显抑制Ⅰ型干扰素效应分子的转录。
2.6 VP0蛋白结合RLRs通路中的IRF3蛋白
双荧光素酶报告基因检测以及实时定量检测同时表明,VP0蛋白抑制I-IFN的产生,为了阐明VP0抑制IFN产生的分子机制,使用免疫共沉淀检测VP0与RLRs信号通路分子的相互作用情况。结果如图 7,将带有Flag标签的VP0分别与带有HA标签的RIG-I、MDA5、VISA、TBK1、MITA和IRF3共同转染后,在IRF3的59 Da处出现一条明显条带,证明IRF3和VP0发生相互作用。在蛋白水平上,进一步证明VP0可能通过与IRF3相互作用从而影响干扰素信号通路。
3 讨论
宿主细胞通过模式识别受体识别外来病原分子模式,进而激活天然免疫应答,产生大量抗病毒因子如抗病毒天然免疫的关键组成部分IFNs、pro-IL-1β和pro-IL-18等,最终清除病原。
宿主细胞模式识别受体包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)。TLRs和RLRs主要识别RNA病毒核酸,通过信号级联放大,最终产生I-IFN。FMDV能够诱导RLRs介导的天然免疫应答,同时,病毒在进化过程中,形成了一系列的策略抑制天然免疫系统应答,如病毒通过不同蛋白分子结合IFN产生信号通路中的关键分子,导致信号传导的终止;或者,病毒通过不同病毒蛋白降解信号通路中的节点分子,导致信号传导的失活。本实验室已发现FMDV 3A蛋白通过结合RLRs信号通路中的3种关键分子RIG-I、MDA5和VISA,最终抑制IFNs的产生,为FMDV的复制增殖提供合适的内部环境[12]。FMDV VP3蛋白通过与VISA相互作用,并降解VISA,最终抑制干扰素信号的激活[13]。FMDV VP3蛋白也可以通过结合降解JAK1(Janus kinase 1) 进而抑制IFN介导的信号转导[14]。如图 8所示,本文通过筛选发现FMDV VP0蛋白能够抑制IFN的产生,VP0蛋白可以明显提高FMDV在BHK细胞上的增殖能力,说明VP0蛋白可能通过影响干扰素以及抗病毒因子的产生促进病毒的复制。通过剂量依赖实验证实VP0蛋白对RLRs介导的IFNs产生的抑制作用。实时荧光定量和双荧光素酶检测系统的结果显示VP0蛋白能够抑制RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN活化作用,然而对于IRF7诱导的IFNs的产生没有抑制效果,这说明VP0蛋白抑制RLRs介导的IFNs产生的水平在IRF3节点或者IRF3的下游节点。使用免疫共沉淀发现VP0蛋白能够结合IRF3蛋白,这说明VP0蛋白可能通过结合IRF3蛋白进而抑制IFNs的产生。本文首次探讨了FMDV VP0蛋白对于RLRs介导的IFNs产生的影响,同时发现VP0蛋白能够通过结合IRF3节点蛋白,进而抑制IFNs的产生,是对FMDV抑制天然免疫分子机制的补充。IRF3属于IRF家族成员,是干扰素信号通路的关键转录因子,在病毒感染早期I-IFN的激活过程中起着重要的作用,因此很多病毒都通过影响IRF3来抑制干扰素的产生。典型猪热病病毒(classical swine fever virus,CSFV)的Npro通过与IRF3蛋白的单体和二聚体相互作用,诱导IRF3的泛素化降解[15];高致病性PRRSV可以影响细胞质内IRF3磷酸化的水平进而抑制干扰素的产生[16]。病毒分子抑制天然免疫的机制非常复杂,对于VP0通过何种途径结合IRF3,进而抑制IFNs的产生;VP0结合IRF3的关键位点;是否影响IRF3的磷酸化水平;对IRF3磷酸化酶是否具有抑制作用,后期我们将继续进行研究。同时对于FMDV VP0是否通过TLR受体抑制IFNs的产生,通过何种分子机制产生影响,也有待于进一步的深入研究。
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