近些年来，随着生物冶金技术的迅猛发展，以及人们环保意识的不断增强，越来越多的嗜酸微生物被广泛用于各种低品位矿石的处理^[1]，同化学冶金方法相比，生物冶金环境污染小，能耗低，浸矿成本低，具有很大潜力的应用价值。研究发现，嗜酸硫杆菌属包含6个种，分别是Acidithiobacillus ferrooxidans、Acidithiobacillus ferridurans、Acidithiobacillus thiooxidans、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrivorans和Acidithiobacillus albertensis^[2-3]。它们可通过氧化亚铁、硫或含硫复合物获得能量，是一种嗜酸、革兰氏染色阴性、短杆状和专性好氧的无机化能自养菌^[4]。其广泛分布在含硫金属矿、含硫温泉、煤矿废渣废堆、微生物冶金操作间、地热和火山口以及酸性矿山废水等处。在嗜酸硫杆菌属中最早被分离出来用于微生物浸矿的菌种是A. ferrooxidans^[5-6]，由于在浸矿过程中表现出诸多优点，其一直是国内外学者研究的焦点。

众所周知，不同地理来源的嗜酸硫杆菌菌株，其生理生化特征千差万别，浸矿能力也存在明显差异^[7]。一系列的研究包括G+C含量测定、DNA指纹图谱RAPD (random amplified polymorphic DNA)、PFGE (pulsed-field gelectrophoresis) 和DNA同源杂交等技术手段均被用于进行相关研究^[8-9]，以发现不同菌株之间的差异，进而进行分子地理学的相关研究。许多基于PCR的DNA分子指纹图谱技术由于其较高的灵敏度、可靠性和可重复性被认为是微生物分类学中强有力的工具，常被用于嗜酸硫杆菌的系统发育分析和遗传差异研究^[10]。吴学玲等^[11-12]采用BOXAIR和 (GTG)₅对21株嗜酸硫杆菌进行了系统的分类和鉴定，发现不同亲缘关系的菌株对Cu²⁺的耐受能力也存在较大差异，不同的嗜酸硫杆菌菌株还具有不同的亚铁氧化途径。Paulino等^[13]采用BOXAIR和ERIC指纹用于鉴定A. ferrooxidans和A. caldus菌株，取得了良好的效果，且研究认为，相对于传统的基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定，ITS序列具有更高的分辨率和较强的种内鉴定能力^[13-14]。但一直以来，该技术在嗜酸硫杆菌鉴定及其系统发育研究方面的报道较少。

此外，Acidithiobacillus可以通过氧化亚铁和含硫复合物参与地球生物化学铁、硫循环中。研究发现Acidithiobacillus中存在2种不同类型的铜蓝蛋白^{[3, 15-17]}，而负责编码这2种蛋白的基因分别为rusA和rusB，它们同属于rus操纵子，同时该操纵子还编码2种细胞色素c和aa₃细胞色素氧化酶，进而参与亚铁氧化^[16]，其中rusA电子传递速率较高，在该过程中的作用显著，而rusB的电子传递速率较低，这一点还有待进一步研究^[18]。

因此，为了研究不同地域、不同环境下的嗜酸硫杆菌菌株的多样性和生态演替规律，以及菌株地理分布的相关性和异质性，本研究采用ITS序列分析其系统发育关系，结合BOXAIR和ERIC指纹图谱技术，同时扩增rus基因，分析不同菌株可能存在的亚铁氧化途径对分离自新疆富蕴、云南腾冲、湖北大冶、江西德兴、江西永平和广东云浮等地的20株嗜酸硫杆菌和3株标准菌株进行实验，并对结果进行分析，比较不同地理来源嗜酸硫杆菌菌株的多样性、遗传差异和亚铁氧化途径，了解在大尺度的空间范围，极端的栖息环境产生明显地理隔离情况下，不同来源的硫杆菌是否具有不同的亚铁氧化途径，是否表现出显著的环境差异，从而为了解冶金微生物谱系地理和分子地理学提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 样品采集和处理

1.1.1 样品采集: 样品采集自中国6个不同的采样地，包括新疆富蕴、云南腾冲、湖北大冶、广东云浮、江西德兴和江西永平。样品经采集后装入已灭菌的保鲜盒中，并迅速运往实验室。样品运回实验室后，部分放置在–80 ℃超低温冰箱，用于菌株分离的样品暂时放在–20 ℃保存，以上步骤均在无菌条件下完成。:

1.1.2 培养方法和培养基: 本实验采用的固体培养基分别是FeTSBo培养基^[19]和Solid 2:2培养基^[20-21]，为了最大限度地避免富集实验对样品的影响，确保获得最大多样性的菌株，我们对用于菌株分离的样品采取不经过富集培养，而是经梯度稀释后，直接进行涂布的方法，稀释梯度分别为10^–1、10^–2、10^–3，每个梯度做3个平行。取0.2 mL稀释液涂布后，经10 d左右，固体培养基表面长出铁锈红色的小菌落时，挑取单菌落接种至装有9 K (pH 2.0) 液体培养基^[22]的锥形瓶中，在170 r/min，30 ℃条件下扩大培养，至培养液变为红棕色，取0.2 mL菌液均匀涂布在固体培养基平板上进行纯化培养。如此交替进行3次，直到在显微镜上观察到菌体形态单一，即认为获得纯培养菌株。: 1.2 DNA提取

将菌株分别转接至400 mL 9 K液体培养基中，于30 ℃、170 r/min条件下进行扩大培养3–5 d，至菌液变成红棕色后，在4 ℃、12000 r/min条件下离心收集菌体后，弃上清，使用稀硫酸 (pH 1.5) 清洗菌斑，去除三价铁沉淀并转移至2 mL EP管中，然后参照Bergamo等^[23]和Mohapatra等^[24]的方法抽提基因组DNA，DNA提取后保存在–20 ℃，采用超微量分光光度计定量核酸浓度和纯度。

1.3 主要试剂和仪器

PCR引物购自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA分子量marker及其他PCR扩增所需试剂均购自天根生化科技 (北京) 有限公司；其余试剂均为进口或国产分析纯；高速冷冻离心机为德国Thermo公司Fresco21型；PCR仪为德国Biometra公司Tprofessional；凝胶成像系统为法国Vilber多功能成像系统；水平电泳仪为美国Bio Rad公司PowerPac Universal、电泳槽SUBCEILGT (20×25 cm)；超微量分光光度计为德国Thermo Scientific Nano Drop 2000/2000C。

1.4 ITS序列的扩增和系统发育分析

采用1对细菌ITS特异性引物 (表 1) 扩增菌株ITS序列。扩增体系 (25 μL) 为：10×Taq PCR master mix 12.5 μL，引物各0.5 μL (20 μmol/mL)，模板1 μL (约50 ng)，用ddH₂O补齐至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min后，进行35个循环 (94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min)，最后72 ℃下延伸8 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工测序公司测序，将所得结果用BLAST序列搜索工具进行比对，获得同源性高的相关种属的序列。再利用CLUSTAL X 1.83软件进行联配，进化距离的计算采用邻接法neighbor-joining method，在MEGA v.5.1软件中用p-distances法和Kimura-2 parameter双参数法建立系统发育树，系统发育树分支的置信度采用bootstrap法，重复1000次。

1.5 rep-PCR指纹图谱聚类分析

本研究采用2种rep-PCR引物BOXAIR和ERIC (表 1)。扩增体系 (25 μL) 为：10×Taq PCR master mix 12.5 μL，模板3 μL (约150 ng)，引物各1 μL (20 μmol/mL)，用ddH₂O补齐至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性7 min后，94 ℃变性1 min，53 ℃ (BOXAIR)/52 ℃ (ERIC) 退火1 min，65 ℃延伸2 min，35个循环，最后72 ℃下延伸16 min。扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶和0.5×TBE电泳缓冲液，在4 V/cm电压下电泳2 h。电泳完成后，使用Vilber多功能成像系统对电泳凝胶进行成像分析。rep-PCR指纹图谱采用GelCompar Ⅱ 5.10 (AppliedMaths，sint-Martens-Latem，Belgium) 凝胶分析软件进行分析，相似性分析采用Pearson系数，使用非加权算术平均连锁法 (UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean) 输出树状图。

1.6 rus基因的扩增及分析

rusA/rusB基因扩增体系 (25 μL) 为：10×Taq PCR master mix 12.5 μL，引物各0.5 μL (20 μmol/mL)，模板1 μL (约50 ng)，用ddH₂O补齐至25 μL。PCR条件：95 ℃ 2 min 30 s；94 ℃变性1 min，55 ℃/61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，最后72 ℃下延伸7 min，目的条带为436 bp/ 440 bp。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果和分析 2.1 嗜酸硫杆菌菌株分离

纯化后的菌株经抽提基因组DNA，采用细菌ITS特异性引物扩增硫杆菌ITS序列，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工测序公司测序，将测序结果进行BLAST序列搜索，以获得同源性高的相关种属的序列，并将其提交至GenBank中，初步鉴定得到的硫杆菌菌株。从鉴定菌株中选取具有代表性的20株嗜酸硫杆菌进行分析研究，本实验使用的3株标准菌株均来自美国模式培养物保藏中心 (American type culture collection，ATCC)，分别为ATCC33020、ATCC23270和ATCC19859。菌株的详细信息见表 2。液体纯培养物经离心后，加入新鲜9 K液体培养液重新悬浮，补充7% DMSO (二甲基亚砜) 后放置在–80 ℃超低温冰箱冷冻保藏^[2]。

2.2 ITS序列系统发育分析

扩增从不同环境中分离筛选出的23株嗜酸硫杆菌菌株的ITS序列并测序，通过NCBI (National Center of Biotechnology Information) 中的BLAST比对工具在GenBank数据库中进行同源性比对，选取同源性最高的序列构建系统发育树见图 1。在系统发育树中，23株嗜酸硫杆菌被划分为5个大类群，表明这些菌株具有较大的异质性。其中绝大多数菌株 (21株) 被划分在前3个类群，在GroupⅠ中包含3个不同地理来源的菌株，与已知2株模式菌株ATCC23270和ATCC19859构成1个分支，且相似性较高，说明其系统发育非常接近，因此可以确定，该类群为A. ferrooxidans；GroupⅡ的菌株来源更加丰富，包括4个不同的地理来源，与A. ferrooxidans JCM7811-P4同源性最高，可确定隶属于A. ferrivorans；Group Ⅲ中以A. ferridurans ATCC33020为代表菌株，包含HBDY-21、HBDY-26、HBDY-29和YNTR-35，在该类群中，除了YNTR-35，其余3株均来自湖北大冶，表明微生物与栖息境有某种程度的关联；Group Ⅳ和GroupⅤ包含菌株较少，与前3个类群明显不同。

ITS系统发育树中Group Ⅳ仅含有1株菌株YNTR-9，分离自云南腾冲热泉，在NCBI序列比对时发现与其最相似的菌株为A. ferrooxidans JCM7811-P1，相似度仅为93%，是一个较为独特的类群，但在系统发育树上，该类群与Group Ⅲ同在1个大的进化枝，亲缘关系较近，因此其可能是A. ferridurans中另1个不同系统发育类群的菌株，表明这2类菌株在生理生化特征方面可能存在不同之处；菌株YFW4-3S与A. ferrooxidans A1构成1个独立分支。

2.3 rep-PCR指纹图谱聚类分析

由ERIC-PCR和BOX-PCR指纹图谱 (图 2，3) 可以清晰看到嗜酸硫杆菌指纹图谱产生的条带较多，能够较好地反映不同硫杆菌菌株在基因组水平上的差异，在实验过程中，为确保实验的可重复性，经重复实验，优化反应条件和反应体系，在较大的程度上保证了数据的可靠性。其中ERIC-PCR指纹图谱分布在400–5000 bp，共产生5–12个可重复且较为明显的条带；BOX-PCR指纹图谱主要集中在200–4000 bp范围内，包括6–13个明显的亮带，两者均有若干较暗的条带；比较2种不同引物指纹图谱可以看出，大多数的PCR产物条带的大小为300–4000 bp，但是不同种的嗜酸硫杆菌带谱明显不同。

在指纹图谱聚类分析中，按照ERIC-PCR相关聚类树形图 (图 2) 将实验中所使用的23株嗜酸硫杆菌划分为4个大类群，而BOX-PCR (图 3) 的聚类树形图却将所有菌株划分为5个类群，与ITS系统发育结果一致，虽然部分菌株在2种聚类分析中存在一些差异，但总体而言，2种引物指纹图谱聚类结果较为接近。

2.4 rus基因扩增结果分析

rus基因的扩增结果如图 4所示，23株不同地理来源的嗜酸硫杆菌菌株中有13株 (DXS6-9S，DXW2-9S，DXW9-2S，YFW4-3S，YPW6-4S，XJFY-9，HBDY-21，HBDY-29，YNTR-9，YNTR-23，YNTR-35，ATCC23270，ATCC33020) 只含有rusA基因，条带大小为436 bp；另外的4株菌株 (DXW2-10S，YFW1-3S，YPS10-5，YPS9-4) 仅含有rusB基因，条带大小为440 bp；其余的6株菌株 (DXS9-14S，YFS2-1S，YFS5-1，YPW3-6S，HBDY-26，ATCC19859) 含有2种类型的rus基因。

2.5 基因分组和系统发育异质性之间的关系

不同地理来源的23株嗜酸硫杆菌的系统发育分组和基因型分组见表 3。其中，大部分菌株的系统发育分组和基因型分组基本是一致的，如ITS系统发育树中GroupⅠ、GroupⅡ和Group Ⅲ的菌株在rep-PCR中也被聚在了一起，但在功能基因分组中，这些菌株表现出了较大的异质性，系统发育的前3个类群中均有3种类型的rus基因，但在系统发育分析中较为特殊的菌株YNTR-9和YFW4-3S却只含有rusA基因、rusA基因和rusB基因编码2种类型的铜蓝蛋白，这2种蛋白在硫杆菌氧化亚铁的过程中具有非常重要的作用^[11]。因此，可以看出，系统发育分型与rep-PCR聚类分型是有联系的，而菌株的亚铁氧化途径却没有表现出与前者的相关性。

3 讨论

本研究中所使用样品采集自中国6个不同样地，实验通过2种不同的固体培养基和9 K液体培养基从样品中分离嗜酸硫杆菌，分离效果良好。采用形态学观察，结合基于ITS序列系统发育树，分离的嗜酸硫杆菌被划分为5个大类群，根据Amouric等^[27]和Hedrich等^[2]对A. ferrooxidans和A. ferridurans的定义，20株嗜酸硫杆菌中有9株属于A. ferrooxidans，4株隶属于A. ferridurans。其中GroupⅠ和GroupⅡ菌包含分离自不同地理来源、不同类型样品的样品，由此可见，同一类群中的菌株也表现出了较高的异质性，可能是由于环境因素促使不同的地理位置出现相似的生态位，导致不同地理来源不同菌株，形成相同或相近的基因型，从而使得其具有较近的亲缘关系而出现在同一类群，该结果与rep-PCR聚类分析一致。

此外，分离自湖北大冶的3株菌 (HBDY-21、HBDY-26和HBDY-29) 均被包含在Group Ⅲ中，说明相同地理来源的菌株，其栖息的生态位也可能相同或相似，遗传差异较小。菌株YNTR-9和YFW4-3S与以上3个种的菌株明显不同，被单独划分为独立类群，在ITS系统发育树中，与YNTR-9最相近的菌株A. ferridurans JCM7811-P1的序列相似性只有93%，因此可以推断YNTR-9或为A. ferridurans的1个亚种，这一点有待进一步研究；YFW4-3S与A. ferrooxidans A1构成1个独立分支，Amouric等^[27]的报道也有类似的表述，文中基于rrs基因的进化树显示A. ferrooxidans A1和A. ferrooxidans A2隶属于含有模式菌ATCC23270的大类群，但前者不同于后者的是前者可以产生较多的胞外多糖，而基于ITS序列的系统发育树中，以上2株菌是同属于A. ferrooxidans的1个独立类群，后面基于rus基因的分析显示，其仅含有rusA基因，因此我们认为其可能是A. ferrooxidans的1个亚种。

在rep-PCR聚类分析中，ERIC和BOXAIR-PCR均表现出了较好的分辨能力，本实验中所使用的23株嗜酸硫杆菌按照ERIC-PCR相关树形图 (图 2) 可被划分为4个大类群，而BOX-PCR (图 3) 却将所有菌株划分为5个类群，虽然部分菌株在2种分类中存在一些差异，如A. ferrooxidans在ITS系统发育和BOXAIR-PCR指纹聚类分析中被划分为2个类群，但在ERIC-PCR中归为1个类群。但总体而言2种引物指纹图谱聚类结果较为接近，部分聚类结果与ITS系统发育相似，菌株ATCC33020、HBDY-26、HBDY-29和YNTR-35在2种指纹图谱聚类分析中都被划分在1个类群中，此外，BOX-PCR指纹图谱将YNTR-9划为1个独立的类群GroupⅤ，与ITS基因系统发育树一致。在表 3中，ITS系统发育树中GroupⅠ、GroupⅡ和Group Ⅲ的菌株在rep-PCR中也被聚类在一起，但在功能基因rus的分组中，这3个类群中存在3种类型的rus基因。有趣的是，在系统发育分析中较为特殊的菌株YNTR-9和YFW4-3S却只含有rusA基因，表明嗜酸硫杆菌的亚铁氧化途径与该菌株的基因型组别、系统发育类群无明显相关性，这可能是因为在长期的进化过程中，所有的菌株对环境压力具有一定的适应性^[11]，从而使得这些菌株具有较大的异质性和丰富的遗传多样性^{[2, 27]}，进一步说明rep-PCR技术在嗜酸硫杆菌种间拥有一定的分类鉴定能力，其中BOX-PCR在聚类中将菌株YFW4-3S与A. ferrooxidans A1划为1个独立分支，与ITS序列系统发育分析结果更为接近，因此可以说明BOXAIR引物更适合区分亲缘关系比较相近的Acidithiobacillus。