察尔汗盐湖位于海西蒙古族藏族自治州格尔木市都兰县境内柴达木盆地中东部，地理坐标为93°42′-96°14′E，36°37′-37°12′N^[1]。该盐湖是典型的大陆性干旱气候，具有年降水量稀少、蒸发量大、日照时间长、辐射力强、昼夜温差大、多风的特点^[2]。盐湖矿区东西长168 km，南北宽20-40 km，面积5856 km²，自东向西依地质特征分为霍布逊、察尔汗、达布逊及别勒滩4个连续的区段^[3]。该盐湖是我国最大的可溶性钾镁盐生产基地，也是仅次于美国大盐湖的世界第二大盐湖。察尔汗盐湖是世界罕见的具有工业价值的大型第四纪内陆盐湖之一。它是一个以液体钾矿为主，杂卤石、软钾镁钒等为次^[4]。

目前，国内外有关盐湖中嗜盐菌的研究报道主要涉及到新菌种的发现、多相分类学的鉴定及菌株同源进化关系方面的研究^[5-10]。有关青海省境内的盐湖地区嗜盐菌的研究主要集中在柯柯盐湖、茶卡盐湖及青海湖这3个区域。柴丽红研究小组成员应用DGGE法对柯柯盐湖和茶卡盐湖样品中分离到的细菌进行多样性差异分析。同时，还对柯柯盐湖中分离到的16株细菌进行了ARDRA筛选及初步的系统发育分析，得到的信息对进一步研究该环境中的微生物多样性具有很重要的指导意义^[11]。姜怡研究小组成员从茶卡盐湖和柯柯盐湖采集的土样中分离到嗜盐放线菌，此外，还有研究人员从茶卡盐湖、柯柯盐湖及青海湖中分离到诺卡氏菌属嗜盐菌菌株^[12-13]。

以上针对青海省境内嗜盐菌的研究均未涉及到察尔汗盐湖地区的微生物资源。由于察尔汗盐湖地域辽阔，环境气候条件特殊，其中必然蕴藏着丰富的极端环境微生物资源，因此是研究嗜盐微生物的理想场所。同时，由于察尔汗盐湖地区地理位置偏远，自然环境恶劣，交通、生活和研究条件特别艰苦，尤其是研究人员还有可能面临着高原反应的考验，因此致使该地区的盐湖资源开发程度较低，有些嗜盐微生物资源至今尚未开发。这就形成了该研究领域的空白，亟待开发。

本研究通过分离可培养的中度嗜盐菌菌株，并对其16S rRNA序列进行系统发育及多样性分析，揭示察尔汗盐湖地区中度嗜盐菌的多样性规律及群落结构特征，从而为发现新颖的微生物资源，为全面、深度地开发具有生防活性的功能性菌株奠定基础。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 供试样品: 2013年7月，采用GPS定位取样点，于青海省海西州察尔汗盐湖地区采集盐湖卤水和盐湖湖泥样品 (表 1)。盐湖卤水盐浓度45%，pH为8.4，采样温度25 ℃。水样与泥样采集后放在无菌的收集瓶里，样品采集完带回实验室立即处理。:

1.1.2 培养基: 选择8种选择性培养基进行嗜盐菌菌株的分离。: (1) 放线菌ISP5培养基：酵母膏5 g，甘油10 g，L-天门冬酰胺1 g，K₂ HPO₄ 1 g，KNO₃5 g，MgCl₂·6H₂O 50 g，微量盐 (FeSO₄·7H₂O 0.2 g，MnCl₂·4H₂O 0.1 g，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g，蒸馏水100 mL) 1 mL，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2-7.4。(2) 放线菌淀粉酪素培养基：淀粉10 g，水解酪素0.3 g，KNO₃ 2 g，MgSO₄·7H₂O 0.05 g，K₂HPO₄ 2 g，CaCO₃ 0.02 g，FeSO₄·7H₂O 10 mg，NaCl 50 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2-7.4。(3) 放线菌改良淀粉酪素培养基：葡萄糖10 g，水解酪素0.3 g，KNO₃ 2 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.05 g，K₂HPO₄ 2 g，CaCl₂·2H₂O 1 g，FeSO₄·7H₂O 10 mg，NaCl 50 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水至定容1000 mL，pH 7.2-7.4。(4) CM改良培养基：水解酪素7.5 g，酵母膏10 g，柠檬酸三钠3 g，MgSO₄·7H₂O 20 g，KCl 2 g，FeSO₄·7H₂O 0.05 g，NaCl 30 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2-7.4。(5) ATCC213改良培养基：MgSO₄·7H₂O 10 g，CaCl₂·2H₂O 0.2 g，KCl 5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏10 g，NaCl 40 g，琼脂粉12 g，蒸馏水至1000 mL，pH 7.2-7.4。(6) M-3培养基：水解酪素7.5 g，酵母膏10 g，柠檬酸三钠3 g，MgSO₄·7H₂O 20 g，KCl 2 g，FeSO₄·7H₂O 0.36 g，MnCl₂·4H₂O 0.36 mg，NaCl 30 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至900 mL，pH 9.5。高压灭菌后，温度降到55 ℃时，加入灭菌的Na₂CO₃母液100 mL。(7) APA培养基：NaCl 50 g，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄·7H₂O 1 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，葡萄糖1 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至800 mL，pH 10。高压灭菌后，温度降到55 ℃时，加入灭菌的质量体积浓度为5%的Na₂CO₃母液200 mL。(8) RM培养基：NaCl 50 g，无水MgSO₄ 9.7 g，柠檬酸钠3.0 g，KCl 2.0 g，无水CaCl₂ 0.2 g，细菌蛋白胨10.0 g，酵母抽提物2.0 g，琼脂粉12 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.5。: 1.2 样品的前处理

水样前处理：为提高实验的可行性，实验先对水样中的菌体进行富集：将滤膜分别装入滤器中，进行121 ℃灭菌30 min，干燥。在无菌条件下，将水样混匀，用装有0.22 µm孔径的滤膜的滤器过滤，在滤膜上富集菌体。用于富集的水样量达到30 mL时，取下滤膜，放入装有3 mL无菌水的玻璃试管中，为10^-1水样。振荡，并放置片刻。之后，将10^-1水样依次梯度稀释为10^-2水样及10^-3水样，备用。

泥样前处理：取适量泥样，风干。称取10 g处理好的泥样，加入90 mL无菌水，放入已灭菌好的装有玻璃球的三角瓶内，充分振荡30 min，静置，吸取上清液，此上清液为10^-1土样。之后，将10^-1泥样依次梯度稀释为10^-2土样及10^-3土样，备用^[14]。

1.3 嗜盐菌的分离、纯化及保存

吸取200 μL上述各样品，均匀涂布于培养基平板上，分别于培养箱中28 ℃和37 ℃静置培养，每天观察培养情况。待培养基平板上有菌落出现时，挑取单一菌落，接种于新的培养基平板上。

将平板纯化好的菌株接种至固体培养基斜面，进行斜面划线，待培养出菌体，加入无菌液体石蜡于4 ℃下恒温保存^[14]。

1.4 嗜盐菌菌株16S rRNA基因组提取与测序

菌株16S rDNA提取按照上海生工生物工程 (上海) 股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。PCR扩增体系：10×Buffer 2.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶 (5 U /μL) 0.2 μL，dNTPs (2.5 mmol/μL) 2 μL，引物F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG G-3′) 和引物P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCA GCCGCA-3′) (10 pmol/μL) 各1 μL，补水至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至派森诺测序。

1.5 构建系统发育树

选择代表性菌株的16S rRNA序列，将结果提交至EzTaxon网站 (http://www.eztaxon.org) 与有效描述菌株的16S rRNA序列相比对，初步判定菌株的分类地位。根据比对结果，通过Mega 5.0软件进行系统发育树的构建^[15]。

1.6 中度嗜盐菌群落结构多样性分析

定义以16S rDNA基因序列相似性低于97%作为不同的操作分类单元 (OTU)。采用Shannon多样性指数、Margalef丰富度指数、Shannon均匀度指数和Berger-Parker优势度指数进行嗜盐菌菌株的多样性分析和比较^[16]。

2 结果和分析 2.1 中度嗜盐菌的分离结果

从15份盐湖卤水与湖泥样品中共分离、纯化得到421株嗜盐菌菌株。分离自卤水样品的菌株共315株，分离自湖泥样品的菌株共106株；8种分离培养基中，从培养基E (ATCC213改良培养基) 中获得菌株190株，数量最多。其次分别为培养基D (CM改良培养基)，共分离到菌株91株。从培养基H (RM培养基) 中分离到菌株88株 (表 2)。

2.2 中度嗜盐菌的系统发育与多样性分析

选取83株具有代表性的中度嗜盐菌菌株进行16S rRNA基因序列分析，结果显示，大部分嗜盐菌菌株与其同属内近缘菌间的16S rRNA基因序列相似性都在98.73%-100.00%之间 (图 1，2)。但有4株嗜盐菌菌株均与Bacillaceae科近缘菌间16S rRNA基因序列相似性较低，分别为：菌株S95与Bacillus solimangrovi (GH2-4) 的16S rRNA基因序列相似性为96.79%，菌株S115与Ornithinibacillus contaminans (CCUG 53201) 的16S rRNA基因序列相似性为97.98%，菌株S165与Bacillus alcalophilus (DSM 485) 的16S rRNA基因序列相似性为97.30%，菌株S181与Ornithinibacillus contaminans (CCUG 53201) 的16S rRNA基因序列相似性为95.34%。这4株菌株为潜在的新属或新种，还需做进一步的研究确定其分类地位。

从盐湖卤水和盐湖湖泥中分离的中度嗜盐菌中选取83株具有代表性的菌株, 经过16S rRNA基因序列分析和系统发育树的构建，结果显示，83株菌株归属于Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria三大类 (图 1，2)。

Firmicutes门包括Bacillus、Gracilibacillus、Paraliobacillus、Halobacillus、Bacillus_g26、Bacillus_g6、Virgibacillus、Ornithinibacillus、Oceanobacillus、Terribacillus、Staphylococcus和Fictibacillus12个不同的属。Actinobacteria门包括Streptomyces、Kocuria和Micrococcus3个不同的属 (图 1，表 3)。Proteobacteria门只包括Halomonas一个属 (图 2，表 3)。

在属水平上，水样中的优势属分别为来自Firmicutes门的Bacillus属、Oceanobacillus属和Proteobacteria门的Halomonas属，分别包含菌株20、15和10株。而泥样中的优势属则为来自Firmicutes门的Bacillus属，包含菌株10株 (表 3)。

多样性指数值计算结果显示 (表 4)，盐湖水样和泥样的多样性指数Shnnon-wiener和Margalef具有明显的差异，说明盐湖水样中分离到的菌株多样性和丰富度明显高于盐湖湖泥样品中分离到的菌株。而水样和泥样的均匀度指数Shannon Eveness差异不明显，说明这两种样品来源中分离到的菌株均匀度没有明显的差异。泥样的优势度指数Berger-Parker dominance Index明显高于水样和总样，说明泥样中分离到的嗜盐菌优势度明显。

3 讨论

中国湖泊总面积约有一半是盐湖，主要集中于内蒙古、西藏、青海和新疆，山西、河北、宁夏、吉林、甘肃等省区也有一部分盐湖^[17]。因此，国内外有关盐湖地区嗜盐微生物的研究很大一部分是由我国研究人员来完成的。目前，我国研究人员对新疆盐湖地区的嗜盐菌研究的最多。研究人员从新疆艾比盐湖和艾丁盐湖中分离到了86株嗜盐古菌，并进行了多样性的分析^[9]。另一研究小组对达坂城盐湖地区的嗜盐菌数量、分类及多样性进行了全面的分析。结果表明，盐度、样品的性质及采样的位置均对微生物的含量具有一定的影响，发现土样中的微生物含量最丰富^[18-20]。还有研究人员对新疆伊吾湖和哈密地区的盐湖嗜盐微生物进行了分离，发现了一部分嗜盐放线菌^{[16, 21]}。

本文从15份采自青海省察尔汗盐湖地区的卤水与湖泥样品中共分离、纯化得到421株菌株，大部分菌株为细菌，少数为真菌。其中，分离自卤水样品的菌株共315株，分离自湖泥样品的菌株共106株，这说明分离自水样的菌株数量远远大于分离自泥样的菌株数量。原因可能是本文中的水样样品经过富集处理后进行菌株分离，同时分离的嗜盐菌菌株全部为中度嗜盐菌菌株。而泥样的采集点距离钾肥厂距离很近，盐度较高，可能其中含有的边缘极端和极端嗜盐菌菌株比中度嗜盐菌数量要多。下一步可以采集这部分样品进行边缘极端和极端嗜盐菌菌株的分离，从而开发更多的极端环境嗜盐菌的资源。

另外，有研究人员从内蒙古锡林浩特地区3个盐湖中分离得到165株嗜盐菌，并进行了ARDRA分析及系统发育树的建立。同时研究人员对分离到的60多株嗜盐菌进行了产脂肪酶菌种的筛选及鉴定^[22-23]。王柏玲还从吉兰泰盐湖中分离到1株海杆菌属 (Marinobacter) 中度嗜盐菌，并进行了多相分类学的鉴定^[24]。此外，研究人员还从舟山地区分离到大量的中度嗜盐菌，表明菌株的形态和菌落的颜色呈现多样性，并对其进行了系统发育分析^[25-26]。为了开发察尔汗盐湖地区的嗜盐微生物资源，本文从分离到的中度嗜盐菌菌株中选择了83株具有代表性的细菌菌株进行了系统发育分析，结果发现有4株嗜盐菌菌株均与Bacillaceae科近缘菌间16S rRNA基因序列相似性较低，有可能为潜在的新属或新种。这就说明察尔汗盐湖这个未被开发的地区将成为发现新颖的微生物菌种资源及新颖微生物来源的天然产物的发源地。

通过系统发育树及进化关系的比对，我们发现水样和泥样的优势门均为Firmicutes门。而在在属水平上，水样中的优势属有3个，分别为来自Firmicutes门的Bacillus属、Oceanobacillus属和Proteobacteria门的Halomonas属。而泥样中的优势属仅有1个，为来自Firmicutes门的Bacillus属。两种样品中相同的优势属均为Bacillus属。结合多样性指数结果分析发现，水样中的菌株多样性高于泥样，而泥样中的菌株优势度高于水样。目前，越来越多的研究人员采用非培养方法在宏基因组方面来分析微生物的群落结构与多样性，研究表明通过DGGE、ARDRA和高通量测序等方法能够发现更多的非培养微生物类群，尤其是高通量测序手段，能够在整体微生物群落水平分析物种遗传多样性。本文中采用可培养的方法培养出的所有嗜盐菌菌株数量及种类相比非培养微生物种类要少，不一定反映该地区中度嗜盐菌菌群结构的全貌，如泥样中应有一部分厌氧菌的存在^[27-30]。另外，作为优势菌属，Bacillus属与4株潜在的新菌株同属于Bacillaceae科，而该科中的部分属尤其是Bacillus属是典型的具有高生物活性的属，在工业上对污水处理可以发挥很好的作用，在农业上具有高杀虫活性^[31-33]。

因此，下一步我们一方面要对察尔汗盐湖地区的微生物资源系统发育及群落结构多样性结合非培养的方式，进行更深入的发掘，另一方面将进行Bacillus属与4株潜在的新菌株的生防活性的筛选，功能性菌株的开发以及活性新颖的天然产物的发现与合成等方面的研究，从而完善察尔汗盐湖地区微生物资源的信息，保护该地区的环境，同时开发具有重要应用价值的微生物与天然产物资源。