2017, Vol. 57中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 唐欢宇, 任海燕, 吴宗福, 陆承平. 2017
- Huanyu Tang, Haiyan Ren, Zongfu Wu, Chengping Lu. 2017
- DNA核酸酶与猪链球菌9型毒力的关系
- Relationship between DNA nuclease and the virulence of Streptococcus suis serotype 9
- 微生物学报, 2017, 57(4): 480-489
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文章历史
- 收稿日期：2016-06-02
- 修回日期：2016-12-06
- 网络出版日期：2016-12-23
引用本文 |
2. 农业部动物细菌学重点实验室, 江苏 南京 210095;
3. 世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室, 江苏 南京 210095
2. Key Laboratory of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, Nanjing 210095, Jiangsu Province, China;
3. OIE Reference Laboratory for Swine Streptococcosis, Nanjing 210095, Jiangsu Province, China
猪链球菌 (Streptococcus suis) 是一种重要的人畜共患病原菌，可导致猪的脑膜炎、心内膜炎、关节炎、败血症等多种疾病[1]。根据荚膜多糖抗原性的不同，猪链球菌可分为33个血清型和部分未定型菌株，其中猪链球菌2型 (SS2) 流行最广，对人和猪的致病力最强[1]。除了SS2以外，猪链球菌9型 (SS9) 也是一个流行血清型，在中国、澳大利亚、荷兰、比利时和德国等国家分离率较高[2-5]。最新研究表明，SS9也可感染人致病[6]。目前，对猪链球菌毒力因子的研究主要集中在SS2，对SS9毒力因子的研究相对较少。
在革兰氏阳性致病菌金黄色葡萄球菌和化脓链球菌中，DNA核酸酶 (SsnA) 是重要的毒力因子。金黄色葡萄球菌DNA核酸酶通过降解中性粒细胞胞外陷阱 (Neutrophil extracellular traps，NETs) 中的DNA，从而抵抗中性粒细胞清除[7]。化脓链球菌DNA核酸酶不仅可以降解NETs的DNA，抵抗中性粒细胞清除[8]，还可以抑制TLR9介导的天然免疫防御和吞噬细胞的杀菌能力[9]。本课题组前期比较蛋白组学发现猪链球菌SsnA存在于SS9毒力株GZ0565中，而在SS9无毒株中不存在，提示SsnA可能是SS9的毒力因子[5]。为明确SsnA对SS9毒力的影响，本研究构建SS9毒力株GZ0565 ssnA无痕缺失株，并比较野生株与缺失株在对斑马鱼毒力、HEp-2细胞黏附、猪全血存活及DNA核酸酶活性等方面的差异，从而为更好阐明SsnA功能、了解SS9致病机制和防控该类疫病提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒和培养条件: 猪链球菌9型GZ0565株于2005年在中国广州分离自患脑膜炎病猪[3, 5]。本研究用到的DH5α和BL21 (DE3) 感受态购自南京诺唯赞生物科技有限公司。构建缺失株所用的质粒pSET-4s由日本动物健康国家研究所Daisuke Takamatsu博士馈赠，质粒详细信息及图谱详见参考文献[10]。HEp-2细胞 (ATCC CCL23) 购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。除特殊标注外，所有的猪链球菌均在37 ℃条件下，培养于THB液体或平板；大肠杆菌在37 ℃条件下培养于LB液体或平板。壮观霉素在需要条件下添加，培养猪链球菌时，壮观霉素终浓度为100 μg/mL，培养大肠杆菌时，壮观霉素终浓度为50 μg/mL，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL。: 1.1.2 主要试剂和仪器: THB购自美国BD公司；限制性内切酶、Premix、T4连接酶、片段回收试剂盒购自TaKaRa生物工程公司；提质粒试剂盒、胶回收试剂盒以及提基因组试剂盒购自Omega公司；绵羊血、抗生素购自北京鼎国生物技术有限公司；RPMI-1640细胞培养液、胰酶等细胞培养相关试剂购自Hyclone公司；THY培养基为添加了5%酵母浸出物的THB。凝胶成像、紫外分光光度计、电击杯、电穿孔仪购自Bio-Rad公司。: 1.2 ssnA缺失质粒的构建以GZ0565基因组DNA为模板，用引物ssnA-A、ssnA-B和ssnA-C、ssnA-D (表 1)，分别扩增ssnA基因的上、下游同源臂ssnA-AB和ssnA-CD片段；以胶回收的PCR产物为模板，ssnA-A、ssnA-D为引物进行融合PCR，扩增ssnA-AD片段；将胶回收的ssnA-AD片段与提取的pSET-4s质粒用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ于37 ℃进行双酶切；酶切片段经片段与质粒连接后转化DH5α感受态，次日挑单菌落进行菌液PCR鉴定；阳性菌落进一步提质粒进行双酶切鉴定，同时送上海桑尼进行测序；测序正确质粒pSET4s-ssnA电转GZ0565感受态，以构建ssnA基因缺失菌株；感受态的制备参照Takamatsu等报道的方法[11]。
| Primers | Sequences (5'→3')a | Restriction sites | Sizes/bp |
| ssnA-A | ATATGCAAGCTTTCAACCCTGCCATGTACCTGCAC | Hind Ⅲ | 1015 |
| ssnA-B | ATGGAAGAGAGAACGGTTTCTAA | ||
| ssnA-C | TTAGAAACCGTTCTCTCTTCCATTGCCTTGTCAAAAAACAAAAA | 1010 | |
| ssnA-D | ATATGCGAATTCTTCCACATCACCAATCATGAA | EcoR Ⅰ | |
| ssnA-X | ACCAGATGGACGAGTCCTACAA | 2274 | |
| ssnA-Y | CATTTCCATAACGACCAGACCT | ||
| ssnA-F | TCTTGTCACTATCGCAGGACG | 464 | |
| ssnA-R | CTGGTCCAGCGATACGACCGGTG | ||
| rssnA-up | GAGTCAGGATCCACAACAACCATTATCCCAAATGATGA | BamH Ⅰ | 1266 |
| rssnA-down | ATACAGGAGCTCTTAGGATTCTTTTTGTTTTTTGACAAGGCAGGTG | Sac Ⅰ | |
| aUnderlined sequences are introduced restriction sites. | |||
1.3 无痕缺失株的筛选
缺失株的筛选参照Takamatsu等[11]方法：将电转阳性菌落划壮观霉素抗性THB平板，28 ℃培养过夜；挑单菌落，37 ℃，加壮观霉素条件下静置培养于THB培养基至浑浊，划壮观霉素抗性平板；挑单菌落，37 ℃，180 r/min，加壮观霉素THB液体传3代；划THB壮观霉素抗性平板，37 ℃培养过夜；挑单菌落于THB液体，28 ℃，180 r/min，不添加抗生素条件下培养于THB液体，传5-10代；传至第5代，取1 mL细菌，10倍比稀释至103，取100 μL细菌稀释液分别涂壮观霉素抗性平板和无抗性平板；观察2个平板菌落数是否有显著差异，若差异显著，则表明有可能发生同源重组；将无抗性平板上的菌落划线有壮观霉素抗性和无壮观霉素抗性的THB平板，28 ℃培养24 h；挑取在无抗性平板上生长，在壮观霉素抗性平板上不生长的菌株用引物ssnA-X、ssnA-Y和引物ssnA-F、ssnA-R同时进行菌液PCR鉴定筛选；最后用引物ssnA-X、ssnA-Y进行PCR测序。
1.4 截短SsnA (rSsnA) 的表达纯化及兔抗血清的制备以GZ0565基因组为模板，用引物rssnA-up和rssnA-down扩增截短的ssnA基因片段；PCR反应产物经DNA回收试剂盒回收后，与表达载体pET-32a连接，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，获得重组表达质粒pET-32a-rssnA；将含有pET-32a-rssnA质粒的BL21 (DE3) 菌液以1:100的比例接种于含100 μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37 ℃摇床180 r/min培养至OD600=0.4时，加入异丙基-β-D-半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度为0.1 mmol/L；继续37 ℃摇床180 r/min培养4 h后，经PBS (pH 7.4) 洗2遍，用上清溶解缓冲液 (磷酸钠20 mmol/L、氯化钠500 mmol/L、咪唑30 mmol/L) 重悬菌体；菌体超声波裂解 (250 W，5 s，间隔10 s，总共30 min) 后，4 ℃、12000 r/min离心5 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。
使用GE Healthcare公司的HisTrap Purification Kit纯化rSsnA融合蛋白，具体方法参照说明书。将纯化后rSsnA背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔，0.5 mL纯化的重组蛋白rSsnA (200 μg) 混合0.5 mL弗氏完全佐剂首次免疫，14 d后用0.5 mL纯化的重组蛋白rssnA (200 μg) 混合0.5 mL弗氏不完全佐剂二次免疫，28 d后用0.5 mL纯化的重组蛋白rssnA (200 μg) 混合0.5 mL弗氏不完全佐剂三次免疫。首次免疫前耳缘静脉采血作为阴性血清，三免后14 d心脏采血，ELISA测定抗体效价。
1.5 Western blot检测SsnAWestern blot方法参照我们前期发表的文章[12]；取1 mL培养至OD600=1的野生株和ΔssnA的菌液，13000 r/min离心2 min，用SDS-PAGE上样缓冲液稀释至0.01 OD/μL，100 ℃水浴10 min使蛋白变性；取10 μL蛋白样品经12% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜 (GE Healthcare)，用含5%脱脂奶的TBST (含0.05% Tween 20的PBS) 37 ℃封闭2 h；根据Tanon TM High-sig ECL Western Blotting化学发光试剂盒 (上海天能) 说明，以兔抗rSsnA血清为一抗 (1:1000稀释)，HRP标记的羊抗兔IgG抗体 (北京鼎国，1:5000稀释) 作为二抗，使用Tanon 5100化学发光仪 (上海天能) 捕捉信号。
1.6 斑马鱼毒力试验斑马鱼毒力试验参照我们前期发表的文章[5, 13-14]。AB纯系斑马鱼，饲养1 w确认健康之后进行毒力试验。野生株GZ0565、缺失株ΔssnA分别在THB血平板上复苏，复苏菌株经斑马鱼复壮后进行攻毒。挑经斑马鱼复壮单菌落过夜培养，第2天早上1:100转接THB液体，37 ℃，180 r/min，培养至OD600=0.6；各取适量菌液，8000 r/min，5 min，4 ℃，经PBS洗2次后，用PBS重悬细菌，并用PBS将细菌分别稀释至104、105、106和107活菌数/mL，用于攻毒试验；取一部分细菌进行倍比稀释，涂THB平板进行计数，以确认斑马鱼体内实际注射的细菌数。斑马鱼随机分成9组，15只/组，其中8组分别经腹腔注射野生株和缺失株不同稀释度细菌悬液，另外一组注射PBS做空白对照；斑马鱼在注射前用90 mg/L甲磺酸三卡因 (MS-222) 进行麻醉；细菌接种后于28 ℃温箱培养，连续观察1 w记录斑马鱼死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死量LD50。
1.7 HEp-2细胞黏附试验野生株GZ0565、缺失株ΔssnA分别在THB血平板复苏，复苏菌株经斑马鱼复壮后进行该试验，参照我们前期发表的文章[15]；挑单菌落过夜培养，第2天早上1:100转接THB液体，37 ℃，180 r/min，培养至OD600=0.6；取1 mL细菌，8000 r/min，5 min，4 ℃，PBS洗2次；用不含血清的RPMI-1640细胞培养基将细菌调整至5×107活菌数/mL；取一部分细菌悬液进行倍比稀释，涂THB固体平板，以确认加入细胞中的实际细菌数；HEp-2细胞稳定培养1 w后，试验前一天晚上铺24孔板，每个细胞孔中加入约1×106个细胞，37 ℃，5% CO2培养过夜，至细胞长满70%-80%；细胞用不含血清的RPMI-1640洗2次，5 min/次；加入1 mL不含血清的RPMI-1640细菌悬液，每株菌做3个重复，800×g，25 ℃离心15 min，37 ℃孵育2 h；细胞板用1 mL PBS洗5次，5 min/次；PBS弃去，加入100 μL胰酶，37 ℃，作用10 min；待细胞消化下来，加入900 μL无菌的ddH2O迅速吹打终止胰酶消化；取100 μL进行倍比稀释，涂THB平板，37 ℃，24 h，计数。同时设不加细胞的阴性对照，比较野生株与缺失株黏附在细胞板的数量。试验重复3次，用非配对t检验做统计学分析。
1.8 猪全血存活试验猪全血存活试验参照我们前期发表的文章，采集经ELISA检测猪链球菌抗体为阴性的健康猪血液[14]。野生株GZ0565、缺失株ΔssnA经血平板复苏后，挑单菌落过夜培养，第2天早上1:100转接THB液体；37 ℃，180 r/min，培养至OD600=0.6；取1 mL细菌，8000 r/min，5 min，4 ℃，PBS洗1次；用适量PBS重悬细菌，使细菌量达到5×106活菌数/mL；取一部分菌液进行倍比稀释，以确认加入血液中的细菌数；另取200 μL细菌悬液与2 mL新鲜血液混匀，37 ℃，每隔15 min上下颠倒混匀，1 h后取100 μL全血培养物进行倍比稀释，涂THB平板计数，以确认细菌在猪血中的存活率，试验重复3次，用非配对t检验做统计学分析。
1.9 DNA核酸酶活性检测DNA核酸酶活性检测参照Nicole de Buhr等的方法[16]。野生株GZ0565、缺失株ΔssnA经THB血平板复苏；挑单菌落过夜培养，第2天1:100转接，37 ℃，180 r/min，培养至OD600=0.6；取1.5 mL，8000 r/min，4 ℃，5 min，THB洗2次，最后用适量体积液体将细菌重悬，细菌浓度控制在OD600=1.8；在比较菌株GZ0565和缺失株ΔssnA对DNA降解程度的试验中，20 μL THB细菌悬液添加40 μL SsnA缓冲液1 (300 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，3 mmol/L CaCl2，3 mmol/L MgCl2) 和适量DNA (λDNA的终浓度为40 ng/μL，细菌基因组DNA的终浓度为32.5 ng/μL)，用THB将终体积补至100 μL，于37 ℃作用24 h；DNA降解程度通过1%的琼脂糖凝胶电泳确定。
为了探讨DNA核酸酶在细菌降解宿主DNA产生脱氧腺苷中的作用，比较了野生株GZ0565和ΔssnA降解λDNA产生磷酸根的含量；细菌的处理与DNA核酸酶活性检测相同，用20 μL SsnA缓冲液2 (100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2) 重悬细菌后添加40 μL SsnA缓冲液1和4 μg λ DNA，用SsnA缓冲液2将终体积补至100μL，于37 ℃作用24 h。细菌降解DNA产生磷酸根的含量通过试剂盒Quanti-Chrom Phosphate Assay Kit (BioAssay Systems) 进行检测，具体的操作参照说明书进行：以上反应液，10000 r/min，离心5 min；取上清，用试剂盒中的空白对照液体稀释至合适的浓度；取50 μL加入96孔板，另取50 μL阳性对照液和空白对照液加入96孔板；各反应孔中加入100 μL反应液，轻轻混匀，室温作用30 min；用酶标仪检测OD620，(1 mg/dL磷酸根等于105.3 μmol/L) 根据说明书公式计算产生的磷酸根的含量，数据用非配对t检验做统计学分析。
2 结果 2.1 ssnA缺失菌株的构建和鉴定用引物ssnA-A、ssnA-B和ssnA-C、ssnA-D，分别扩增ssnA基因的上、下游同源臂AB和CD片段，经PCR融合后，与pSET-4s质粒相连。缺失质粒经PCR和酶切鉴定，融合片段大小2025 bp，表明成功构建缺失质粒pSET4s-ssnA (图 1-A，B)。
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| 图 1. pSET4s-ssnA PCR以及酶切鉴定 Figure 1. PCR and restriction endonuclease confirmation of pSET4s-ssnA. A: PCR confirmation of pSET4s-ssnA. Lane 1: primers ssnA-A/ssnA-D, pSET4s-ssnA as template; lane 2: primers ssnA-A/ssnA-D, pSET4s as negative control; M: DNA marker DL5000. B: Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid pSET4s-ssnA. Lane 1: pSET4s-ssnA digested by Hind Ⅲ and EcoR Ⅰ; lane 2: pSET4s digested by Hind Ⅲ and EcoR Ⅰ as negative control; M: DNA marker DL5000. |
按照无痕缺失方法，将缺失质粒pSET4s-ssnA电转化GZ0565感受态细胞，挑选无痕缺失株。用引物ssnA-F/ssnA-R扩增ssnA基因内部片段，野生株GZ0565中可扩增出464 bp的片段，从缺失株中则不能扩增出该片段；用引物ssnA-X/ssnA-Y区分野生株和缺失株，在野生株GZ0565中能扩增出5334 bp的片段，从缺失株则扩增出2274 bp的片段 (图 2)。上述结果表明，ssnA缺失株ΔssnA成功构建。
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| 图 2. ΔssnA PCR鉴定 Figure 2. PCR confirmation of the deletion mutant △ssnA. Lane 1: primers ssnA-X/ssnA-Y, GZ0565; lane 2: primers ssnA-X/ssnA-Y, △ssnA; lane 3: primers ssnA-F/ssnA-R, GZ0565; lane 4: primers ssnA-F/ssnA-R, △ssnA; M: DNA marker DL5000. |
2.2 rSsnA的表达及Western blot检测SsnA
含有重组质粒pET-32a-rssnA的BL21 (DE3) 经IPTG诱导后4 h，样品处理后经SDS-PAGE电泳，如图 3所示，菌体表达了分子量为64 kDa左右的融合蛋白 (rSsnA分子量45.4 kDa加上pET-32a融合片段18 kDa)，且融合蛋白主要表达在超声裂解上清中。
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| 图 3. SDS-PAGE检测rSsnA表达 Figure 3. The expression of rSsnA analyzed by SDS-PAGE. M: Protein molecular weight marker; lane 1: BL21 (DE3) containing pET-32a-rssnA without IPTG induction; lane 2: BL21 (DE3) containing pET-32a-rssnA with IPTG induction for 4 h; lane 3: the supernatant of BL21 (DE3) after sonication that contains pET-32a-rssnA with IPTG induction. |
将野生株GZ0565和ΔssnA全菌蛋白经SDS-PAGE并转至PVDF膜后，分别以兔抗rSsnA血清和免疫前的阴性血清作为一抗进行Western blot检测。如图 4-A所示，以兔抗rSsnA血清为一抗时，GZ0565在112 kDa处有明显条带 (SsnA全长为112 kDa)，而ΔssnA未见相应条带；如图 4B所示，以免疫前的阴性血清作为一抗，GZ0565和ΔssnA均未见相应大小条带，证实缺失株不能表达SsnA。
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| 图 4. Western blot检测SsnA蛋白 Figure 4. Western blot analysis of SsnA expression. A: M: protein molecular weight marker; lane 1-2: wild type strain GZ0565 was probed with rabbit anti-rSsnA serum; lane 3-4: ΔssnA was probed with rabbit anti-rSsnA serum; B: M: protein molecular weight marker; lane 1-2: wild type strain GZ0565 was probed with rabbit serum before immunization; lane 3-4: ΔssnA was probed with rabbit serum before immunization. |
2.3 斑马鱼毒力试验
将野生株GZ0565和ΔssnA分别攻击斑马鱼，计算其LD50，结果如表 2所示，GZ0565对斑马鱼的LD50为1.75×105活菌数/尾，而ΔssnA对斑马鱼的LD50为1.96×106活菌数/尾，缺失株的LD50是野生株的11.2倍 (表 2)，证实ssnA缺失后对斑马鱼毒力降低。
| Dose of infection (CFU) | Mortality of mice | |||
| GZ0565 | ΔssnA | GZ0565 | ΔssnA | |
| 1.12×108 | 7.00×107 | 14/15 | 14/15 | |
| 1.12×107 | 7.00×106 | 14/15 | 12/15 | |
| 1.12×106 | 7.00×105 | 11/15 | 4/15 | |
| 1.12×105 | 7.00×104 | 3/15 | 1/14 | |
| LD50 | 1.75×105 | 1.96×106 | ||
2.4 HEp-2细胞黏附试验
HEp-2细胞是评价猪链球菌黏附宿主细胞的较好体外模型[17]。为探究SsnA对SS9黏附宿主细胞能力的影响，比较了野生株GZ0565和ΔssnA对HEp-2细胞的黏附能力。与野生株相比，ΔssnA对HEp-2细胞的黏附能力极显著下降 (P < 0.01)，仅为野生株的60.61% (图 5)；同时设不加细胞的阴性对照，野生株与缺失株黏附在细胞板的数量活菌数无显著差异。
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| 图 5. GZ0565和ΔssnA对HEp-2细胞的黏附率 Figure 5. The adherence rate of wild type strain GZ0565 and ΔssnA to HEp-2 cells. The adherence rate of ΔssnA was only 60.61%±6.65% (Mean±SD) of wild type level. **P < 0.01. |
2.5 猪全血存活试验
要引起宿主致病，猪链球菌首先必须要能在血液中存活[18]。为探讨SsnA对SS9在猪血液中的存活能力的影响，比较了野生株GZ0565和ΔssnA在猪全血中的存活。如图 6所示，ssnA缺失后，缺失株在血液中的存活能力极显著下降 (P < 0.01)，仅为野生株的71.88%。
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| 图 6. GZ0565和ΔssnA在猪全血中的存活率 Figure 6. Survival rate of GZ0565 and ΔssnA in pig blood. The survival rate of ΔssnA in pig blood was only 71.88%±6.76% (Mean±SD) of wild type level. **P < 0.01. |
2.6 DNA酶活性的检测
为证实SS9 SsnA降解DNA活性，分别以线性DNA (λ DNA) 和环状DNA (GZ0565基因组DNA) 为底物，比较野生株和ΔssnA降解DNA能力。如图 7所示，与野生株GZ0565相比，ΔssnA降解DNA的能力明显降低。有研究表明，金黄色葡萄球菌DNA核酸酶降解宿主DNA，进而核苷酸酶进一步降解产生脱氧腺苷和磷酸根，产生的脱氧腺苷介导巨噬细胞凋亡，促进细菌在体内增殖，可通过检测磷酸根的量判定产生脱氧腺苷的水平[19]。通过检测磷酸根的浓度，比较野生株和ΔssnA降解DNA产生脱氧腺苷的水平。如表 3所示，与野生株相比，ΔssnA降解DNA产生磷酸根含量极显著降低 (P < 0.0001)，提示产生更少的脱氧腺苷。
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| 图 7. GZ0565和ΔssnA降解DNA试验 Figure 7. Electrophoretic analysis of DNA degradation by strain GZ0565 and ΔssnA. Lane 1: Control GZ0565 genome DNA; lane 2: GZ0565 genome DNA+strain GZ0565; lane 3: GZ0565 genome DNA+strain ΔssnA; lane 4: Control λ DNA; lane 5: λ DNA+strain GZ0565; lane 6: λ DNA+strain ΔssnA; M: DNA Marker DL5000. |
| Strains | Average of total concentration of Pi (μmol/L) |
Bacteria added (CFU/mL) | Ability of bacteria to produce Pi (nmol/min/108cells) |
| GZ0565 | 107.0 | 1.31×109 | 0.272 |
| ΔssnA | 39.0 | 8.05×108 | 0.161 |
3 讨论
Fontaine等已经确定SsnA分泌于SS2上清中，证明从内在器官中分离的菌株与表达该酶具有正相关，但并未对其功能进行深入研究[20]。Nicole de Buhr等通过体外实验 (in vitro) 证实SS2 SsnA能够有效降解中性粒细胞胞外陷阱 (Neutrophil extracellular traps，NETs)[16]，但并未通过动物实验证实其对细菌毒力的影响。虽然Haas等通过转座子插入方法筛选SS2 ssnA突变株，突变株对阿米巴毒力降低[21]，但转座子存在多位点插入的可能，除了ssnA基因外，可能还存在其他基因的突变。
本研究通过无痕缺失方法，成功构建ssnA无痕缺失株。通过体内外等一系列实验，证实SsnA是SS9毒力因子，且ssnA缺失后细菌黏附HEp-2细胞、在猪全血中存活及分解DNA能力显著降低。金黄色葡萄球菌在感染宿主的过程中，DNA核酸酶降解NETs中DNA，进而核苷酸酶进一步降解产生脱氧腺苷和磷酸根，产生脱氧腺苷介导巨噬细胞凋亡，促进细菌在体内增殖[19]。本实验首次证实猪链球SsnA也可促进细菌降解DNA产生磷酸根，提示产生更多的脱氧腺苷。是否猪链球菌SsnA也能参与细菌介导宿主免疫细胞凋亡，促进细菌在体内增殖，值得后续深入研究。
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