环二腺苷酸单磷酸(cyclic diadenosine monophosphate，c-di-AMP)是新发现的第二信使分子，参与细菌多种生理功能的调节。c-di-AMP可以调节细菌对K⁺的转运，但目前该调控机制还没有被系统描述。本文主要综述了细菌内c-di-AMP调控K⁺转运的机制。

钾是生物体所必需的微量元素，主要以钾离子(K⁺)的形式存在于生物体中^[1]。对于人体来说，长期缺钾，会有心律不整、神经传导不正常、呕吐等症状^[2]。植物中钾与光合作用和呼吸作用有关，缺少钾会引起叶片收缩、发黄或出现棕褐色斑点等现象。在细菌中，K⁺主要维持胞内恒定的pH、渗透压和正常的膜电位^[3]，K⁺的存在还会影响胞质内酶蛋白的活力^[4]。除此以外，K⁺还作为重要的信号分子，调节基因表达^[5]，参与细菌其他代谢途径的调控^[6-7]。对于细菌来说，胞内K⁺浓度的升高被认为是细菌对外界环境中高浓度NaCl的响应^[1]。

与高等动物不同，原核生物中并不存在Na⁺/K⁺ ATP泵，而细菌胞内的K⁺浓度通常会高于外界环境，为了控制K⁺的输入与输出，细菌拥有一系列的K⁺转运系统(K⁺ transport systems)、离子通道(ion channels)等来维持胞内的K⁺浓度。

1 细菌中的离子通道

各物种拥有的K⁺转运系统，可能是由原始的离子通道演化而来^[8-9]。依目前的研究来看，K⁺转运系统因能更特异、更高效地转运K⁺，可能会逐渐替代K⁺通道。将大肠杆菌(Escherichia coli)中编码K⁺通道的基因kch敲除后，不同的培养条件和压力都不会使突变株的生长受到影响；敲除枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的K⁺通道基因也不会使其产生表型变化^[9]；而且基因组信息显示大多数细菌中并不存在编码K⁺通道的基因。可能是原核生物在进化过程中，K⁺通道逐渐被淘汰了。

2 细菌中的K⁺转运系统

K⁺转运系统在细菌转运K⁺的过程中起主要作用。目前，已经报道的K⁺转运系统有Kdp系统、Trk系统、Kup系统^[10]和Ktr系统。经过深入研究，对各K⁺转运系统的组成及功能已较清楚。

2.1 Kdp系统

Kdp系统是一种可诱导、高亲和性的K⁺转运系统^[11]。Kdp系统由双组分系统(two components system) KdpD/KdpE和KdpFABC复合物组成，KdpD是锚定在膜上的组氨酸激酶(histidine kinase)，可以响应外界信号，如Na⁺、NH₄⁺等^[12]。当受到外界刺激时，KdpD会被磷酸化，已磷酸化的KdpD将磷酸基团传递给响应调节子(response regulator) KdpE，增加KdpE对kdp操纵子启动子区的亲和性。KdpE结合在kdp操纵子的启动子区，起始kdp操纵子的转录，最后形成KdpFABC复合物转运K⁺。KdpA主要负责K⁺的转运。K⁺转运过程中所需的能量由P型的ATP酶——KdpB提供，KdpB可以结合并水解ATP释放能量。KdpC通过氨基端的跨膜螺旋锚定在膜上，增加KdpB对ATP的亲和力^{[1, 3, 13-14]}。KdpF是有单一跨膜结构域的疏水蛋白，主要维持KdpFABC复合物的稳定性^[15] (图 1)。

Kdp系统广泛分布于各类细菌中，但是不同菌株中的Kdp系统，其操纵子的组成和排列方向有差异。在酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)中，KdpD被分为两部分，但是并没有失去组氨酸激酶的功能^[11]。

2.2 Ktr系统

Ktr系统是一种依赖Na⁺的K⁺转运系统。在菌株Synechocystis sp. strain PCC 6803中，Ktr系统是主要的K⁺转运系统。由KtrA、KtrB和KtrE组成。KtrB形成转运K⁺的核心组件，KtrA和KtrE协助KtrB特异性地运输K^+[16]。在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中，Ktr系统由二聚体膜组分KtrB与KtrD以及胞质闸组分(gating component) KtrC或KtrA组成。Ktr系统的转运活性由结合在KtrA/KtrC上的核苷酸分子调控，当ATP结合在KtrA/KtrC上，Ktr系统转运K⁺的能力增强^[1]。

2.3 Trk系统

Trk系统是大肠杆菌转运K⁺的主要系统之一，相对于大肠杆菌有多种K⁺转运系统，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)基因组中注释的只有1种Trk系统^[17]。Trk系统是一个质子转运体，由1种跨膜蛋白和1个结合核苷酸的外周膜蛋白组成，在转运过程中需要质子动力和ATP。在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中，Trk系统由2个高度同源的TrkA蛋白CeoB和CeoC组成，CeoB和CeoC由操纵子ceoBC编码。TrkA是一个亲和性较低的K⁺转运蛋白，在中性pH、需氧条件下转运K^+[18-19]。

2.4 其他K⁺转运系统

Kup系统与其他K⁺转运系统没有同源性，且Kup系统转运K⁺的能力很弱，在大肠杆菌中，Kup系统转运K⁺的能力只有Trk系统的1/10^[10]。

还有一些跨膜的离子转运蛋白，例如CpaA (cation proton antiporter A)^[20]，也能运输K⁺。但对K⁺亲和性不高，对K⁺的转运没有特异性。

3 c-di-AMP调控K⁺的转运

2008年，在解析DisA (DNA integrity scanning protein A)的晶体结构时意外发现了第二信使分子——c-di-AMP^[21]。含有DAC结构域(diadenylyl cyclase domain)的二腺苷酸环化酶(diadenylate cyclase)可以利用2分子ATP合成1分子c-di-AMP^[21-22]。含有DHH结构域(Asp-His-His domain)、DHH/DHHA1结构域(因与DHH结构域毗连，所以被命名为DHHA1结构域)和HD结构域(His-Asp domain)的磷酸二酯酶(phosphodiesterase)则可以将c-di-AMP降解为5′-pApA或AMP^[23-24]。生物信息学分析表明DAC结构域、DHH/DHHA1结构域和HD结构域在原核生物中广泛分布，说明c-di-AMP在原核细胞中普遍存在。

c-di-AMP参与细菌多种生理功能的调节，例如调控脂肪酸代谢^[25]、细菌在低盐环境的耐受性^[20]、损伤DNA的修复^[26]、细菌细胞壁的代谢平衡^[27]、细菌的毒力^[28-29]、芽胞的形成^[30]以及生物被膜的产生^[31]。作为第二信使分子，c-di-AMP通过与相应的受体特异性结合发挥调控作用。目前，已报道c-di-AMP的受体主要有蛋白质类以及属于RNA调控元件的核糖开关(riboswitch)两大类^[32-35]。c-di-AMP通过直接与蛋白类受体结合以及与K⁺转运蛋白编码基因5′-非翻译区(5′-untranslated region，5′-UTR)的核糖开关结合来调控K⁺的转运。

3.1 c-di-AMP结合蛋白类受体调控K⁺转运

虽然c-di-AMP被发现的较晚，但其调节功能已引起人们极大的兴趣。目前鉴定到的c-di-AMP蛋白受体越来越多，包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中TetR(tetracycline resistance)家族转录因子DarR^{[25, 33]}、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)和信号转导蛋白PstA^{[34, 36-37]}，以及李斯特菌(Listeria monocytogenes)宿主的跨膜蛋白STING^[38]。重要的是，c-di-AMP还与参与调控K⁺转运的KdpD以及K⁺转运蛋白KtrA、CapA和TrkA等特异性结合，从而调控K⁺转运^{[20, 39]}。

c-di-AMP可以与双组分系统KdpD/KdpE中的KdpD结合。在金黄色葡萄球菌中，c-di-AMP与KdpD的USP结构域(universal stress protein domain)特异性结合^{[20, 39]}(图 1)。通过序列比对，发现KdpD广泛存在于细菌中，与金黄色葡萄球菌序列同源的KdpD分别存在于绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉状菌门(Planctomycetes)、衣原体门(Chlamydiae)、螺旋体门(Spirochaetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)；然而当用金黄色葡萄球菌KdpD的USP结构域作为查询序列时，KdpD的同源蛋白只存在于厚壁菌门与变形菌门中^[39]。生物信息学分析结果表明，在厚壁菌门、放线菌门和部分变形菌门细菌中，存在合成c-di-AMP的DAC结构域。因此，可以推测，c-di-AMP与KdpD结合后调控kdp操纵子的表达，从而调控K⁺的转运，这种调控方式至少在厚壁菌门和少数变形菌门细菌中占据重要地位。例如，在金黄色葡萄球菌中高浓度的c-di-AMP抑制kdp操纵子的转录，而使细菌在低钾条件下的生存能力下降^[39]。

c-di-AMP可以与KtrA的RCK_C结构域结合。KtrA是Ktr系统的胞质闸组分，由氨基端的RCK_N结构域和羧基端的RCK_C结构域组成(图 2-A)^{[20, 40]}。RCK_N结构域可以与ATP或NADH结合，为K⁺的转运提供能量，并与膜组分KtrB或KtrD互相作用，共同完成K⁺的转运^{[1, 20]}。RCK_C结构域裸露在胞质中，可与c-di-AMP结合，调节K⁺的转运(图 2-A)。实验表明，金黄色葡萄球菌ktrA缺失突变株与c-di-AMP降解酶gdpP缺失突变株的生存能力均下降^[20]，表明高浓度的c-di-AMP不利于K⁺的转运。枯草芽胞杆菌、李斯特菌中c-di-AMP同样可以结合KtrA，参与K⁺转运的调控^{[18, 32]}。在枯草芽胞杆菌中，5个含有RCK_C结构域的蛋白都与K⁺等一价离子的转运有关^[32]。

c-di-AMP可与CpaA结合。CpaA是一个离子转运蛋白，可以将胞内的K⁺与Na⁺输送到胞外，同时向胞内输送H⁺。c-di-AMP也与CpaA的RCK_C结构域结合(图 2-B)^[41]，增加CpaA的转运活性，加速胞内K⁺的流失。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中Trk系统由TrkA与TrkH组成。最新研究发现，当TrkA与TrkH结合后，促进K⁺的摄取。而胞质中的c-di-AMP又可与TrkA结合(图 2-C)，结合c-di-AMP的TrkA对TrkH的亲和力下降，两者的结合受到阻遏，从而影响细菌对K⁺的摄取^[42]。高浓度的c-di-AMP抑制Trk系统对K⁺的转运。

c-di-AMP的蛋白类受体有很多与K⁺的转运相关，c-di-AMP与受体结合后，会改变受体原有的功能或活性。一般而言，高水平的c-di-AMP会抑制细菌对K⁺的吸收、降低胞内的K⁺浓度。

3.2 c-di-AMP通过结合核糖开关调控K⁺的转运

c-di-AMP可与核糖开关特异性结合，调节下游基因的转录和翻译^[35]。核糖开关是位于mRNA 5′-UTR的一种RNA元件，由适配体区(aptamer domain)和表达平台区(expression platform)组成。适配体区与特异的配体结合后，引起核糖开关构象的改变，在转录时形成终止子(terminator)或抗终止子(anti-terminator)结构或在翻译时形成隔离子(sequestor)或抗隔离子(anti-sequestor)结构，调控下游基因的转录或翻译^[43-44]。

特异性响应c-di-AMP的核糖开关在Rfam中被注释为ydaO，1分子ydaO可以结合2分子c-di-AMP^[45]。2004年，Breaker团队报道了ydaO，但是因没有找到合适的配体，认为其是“孤儿核糖开关”^[46]。直到2013年，Breaker团队才确认ydaO的配体是c-di-AMP^[47]。

ydaO广泛地分布在原核生物中，包括绿弯菌门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、酸杆菌门、梭杆菌门(Fusobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)，且下游基因功能具有多样性。这表明细菌可以通过ydaO调控多种生理功能，主要包括：细胞壁的代谢、Na⁺/K⁺的转运、芽胞的萌发及氨基酸或其他代谢物的转运等。基因组信息显示，在变形菌门、厚壁菌门和疣微菌门中，ydaO都参与调控K⁺的转运(图 3)^[47-48]。

在厚壁菌门的不同细菌中，ydaO分别调控kdp、ktr和trk操纵子等K⁺转运基因的表达；变形菌门中，ydaO分别位于trk和kup操纵子的5′-UTR；疣微菌门中，ydaO调控kup基因的表达(图 3)^[47]。c-di-AMP可以通过核糖开关控制K⁺转运蛋白基因的表达，调控K⁺转运。

实验研究过程中，我们发现蜡样芽胞杆菌群(Bacillus cereus group)中kdp mRNA的5′-UTR普遍存在一个ydaO。将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中的c-di-AMP合成酶敲除后的突变株ΔdisA、ΔcdaA、ΔcdaS、ΔdisAΔcdaS及ΔcdaAΔcdaS中，检测到胞内c-di-AMP浓度降低^[30]。用RT-qPCR实验检测kdp操纵子转录量的变化，发现在c-di-AMP合成酶缺失株中，kdp操纵子的转录量增加。说明该ydaO为转录抑制型核糖开关，当胞内c-di-AMP的浓度低时，ydaO打开，下游基因顺利转录，形成有活性的K⁺转运蛋白转运K⁺(图 4-A)。胞内c-di-AMP浓度高时，ydaO关闭，转录终止，抑制下游基因的转录(图 4-B)。ydaO下游基因的转录受c-di-AMP浓度的严格调控。

综上所述，无论是通过蛋白受体还是核糖开关调控K⁺的转运，高浓度c-di-AMP都扮演抑制细菌对K⁺的吸收、降低胞内K⁺浓度的角色。

4 问题和展望

K⁺转运的调控对细菌的生存极为重要，合适的K⁺浓度有助于细菌适应环境中盐浓度的改变，控制胞内酶的活性，调节胞内酸碱平衡以及保持适当的细胞膜电位。也许K⁺的转运还受其他胞外或胞内信号的调控，但是胞内c-di-AMP对K⁺转运的调节是一种非常重要的调控方式，为揭示细菌内部复杂的调控网络打开了新的一页。但是，细菌胞内含有c-di-AMP时，是否其K⁺转运就一定受c-di-AMP调控呢？在同一细菌中，c-di-AMP通过蛋白与核糖开关调控K⁺转运这两种调控方式是否同时存在？c-di-AMP是否与核糖开关结合后控制蛋白的翻译起始过程？K⁺浓度的变化是否影响c-di-AMP的合成？以及c-di-AMP是否有新的蛋白受体或其他新功能，都需要进一步研究。

c-di-AMP对细菌的调控功能具有一定的应用潜力，可以作为药物筛选的靶标，用于防止病菌感染；在生产应用方面，c-di-AMP调控K⁺转运的方式为优化菌株的培养和工作条件提供了理论基础。