2017, Vol. 57中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 吴曼莉 , 李晓宇 , 张楠 , 徐爽 , 柳志强 . 2017
- Manli Wu, Xiaoyu Li, Nan Zhang, Shuang Xu, Zhiqiang Liu . 2017
- 胶孢炭疽菌CgRGS2基因的克隆及生物学功能
- Gene cloning and biological function of CgRGS2 in Colletotrichum gloeosporioides
- 微生物学报, 2017, 57(1): 66-76
- Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(1): 66-76
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文章历史
- 收稿日期：2016-05-04
- 修回日期：2016-08-25
- 网络出版日期：2016-09-05
引用本文 |
炭疽菌(Colletotrichum spp.)是一类重要的植物病原真菌，其分布广泛且种内变异较多[1]。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是一种重要的炭疽病菌，可以侵染多种作物，特别是热带及亚热带地区的水果、蔬菜、林木等经济作物，造成严重的损失[2]。例如由该病菌引起的芒果炭疽病是全世界芒果种植区发生最普遍、危害最严重的病害之一，由于其潜伏侵染的特性，在采后贮藏过程中也极易造成果实腐烂，严重影响芒果的产量和品质[3-4]。胶孢炭疽菌不仅寄主范围非常广泛，其侵染策略也多种多样，目前对于该病菌的防治也较为困难[5]。因此，深入解析该菌在致病过程中相关基因的功能及调控网络，对于了解胶孢炭疽菌与宿主的互作机制，进而有效的防治该病菌具有重要的理论和实践意义。
G蛋白信号途径是真核细胞感受及传递外源信号的重要途径之一，参与调控真菌的生长发育、生殖、交配、侵染以及致病等相关过程[6-7]。G蛋白由其偶联的受体蛋白(G protein-coupled receptor，GPCR)激活[8]，当信号配体结合到GPCR时，与Gα亚基结合的GDP转变为GTP，引起异三聚体的构象发生改变，促使Gα与异二聚体Gβγ解离[9]。Gα和Gβγ分别作为有活性的信号分子激活下游的靶蛋白，从而引起一系列生理活动。激活的G蛋白随后经Gα自身的GTP酶水解活性水解GTP为GDP，Gα与Gβγ又重新聚合到一起形成失活的异三聚体。G蛋白信号调控因子(Regulators of G-protein signaling，RGS)是G蛋白的负调控因子，作为GTP酶激活蛋白促进Gα亚基对GTP的水解，使G蛋白失活，从而迅速关闭G蛋白信号途径[10-11]。不同类型的RGS蛋白在分子大小、氨基酸同源性和结构域等方面存在很大的差异，但是大多数家族成员都共同拥有一个保守的RGS结构域[12]。RGS结构域是RGS蛋白发挥GTPase激活作用的结构基础和关键所在，它的缺失将导致蛋白丧失GTPase激活活性[13]。相关实验结果表明，RGS蛋白参与包括细胞增殖、细胞分化、质膜运输、细胞运动和胚胎发育等多个G蛋白信号通路介导的细胞内过程[14]。RGS蛋白在稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)等多种植物病原真菌中得到鉴定，参与调控包括营养菌丝生长、孢子形成、有性生殖、毒素及色素的产生和致病性等重要生理过程[11, 15-16]。然而，目前还未有关于胶孢炭疽菌RGS蛋白生物学功能的研究。在前期研究中，我们从胶孢炭疽菌中鉴定了10个潜在的RGS蛋白，它们都包含RGS功能域，本研究克隆并鉴定了其中一个RGS基因，经比对发现其与稻瘟病菌中MoRGS2为同源基因，所以将该基因命名为CgRGS2，利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体，并在突变体的基础上获得了互补株，通过表型分析确定了CgRGS2的生物学功能。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)野生型菌株(WT)由海南大学环境与植物保护学院保存。 1.1.2 培养基 (1) PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L，琼脂粉18 g/L。(2) LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，琼脂粉18 g/L。(3) CM培养基：胰蛋白胨6 g、酵母提取物6 g、蔗糖10 g，琼脂粉18 g/L。(4) CZAPEK培养基：蔗糖30.00 g、NaNO3 3.00 g、MgSO4 0.50 g、K2HPO4 1.00 g、FeSO4 0.01 g、KCl 0.50 g，琼脂粉18.00 g/L。(5) MM培养基：K2HPO4 7.0 g、KH2PO4 3.0 g、(NH4) SO4 1.0 g、MgSO4 0.1 g、柠檬酸钠0.5 g、葡萄糖5.0 g，琼脂粉18.0 g/L。 1.1.3 主要试剂 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶(PstⅠ，KpnⅠ，XbaⅠ，BamHⅠ)及PCR相关试剂等均购自TaKaRa公司；引物合成和测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 CgRGS2基因的克隆及序列分析胶孢炭疽菌总R N A提取采用Ta K a R a MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa，中国)，利用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，中国)合成cDNA。以胶孢炭疽菌cDNA为模板，利用引物CgRGS2F和CgRGS2R (表 1)扩增CgRGS2的ORF框，PCR产物经切胶回收、连接、转化、鉴定后送上海生工测序公司测序。利用S M A RT (http://smart.embl-heidelberg.de/)工具对CgRGS2进行蛋白结构域分析，通过GenBank中BLASTp工具对CgRGS2进行蛋白同源性分析，用Clustal X (1.83)软件进行多序列比对，利用MEGA 5.0软件以邻近相接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树。
| Primers | Sequences (5'→3) |
| CgRGS2upF | AACTGCAGCGCCTGATTGACACTATTGGAG |
| CgRGS2upR | GGGGTACCGGAAGGGTAGATGACCTGGAAG |
| CgRGS2F | ATGTCGAGATCCAGGCCCACC |
| CgRGS2R | TTAACTAGAGGTGCTGCTTGCG |
| CgRGS2downF | GCTCTAGACGGCGTTCAGTTCCTTACCTT |
| CgRGS2downR | AACTGCAGACATCATGTCGGAGGAGTTGG |
| CgRGS2UU | ACGCCTACCATTCCTTGCCTTACGG |
| PI | CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG |
| PI1 | GTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG |
| CgRGS2DD | ATCGAGACCGAAGTAGCAAAGCATC |
| CgRGS2hbF | CGGGATCCCCTCCACCTGAGCGACACGACTTAT |
| CgRGS2hbR | AACTGCAGTCTTTGTTACACGACGCAACTATCT |
1.3 CgRGS2基因的敲除与互补
CgRGS2基因敲除原理见图 1。参照文献[17]方法提取胶孢炭疽菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别利用引物CgRGS2upF和CgRGS2upR，CgRGS2downF和CgRGS2downR (表 1)扩增CgRGS2基因的上下游序列。将扩增得到的基因上下游片段通过回收纯化后分次连接到pCB1532上，通过酶切验证，获得敲除载体pCB1532-CgRGS2。将pCB1532-CgRGS2通过PstⅠ酶切进行线性化，转化到胶孢炭疽菌野生型菌株的原生质体中，原生质体制备及转化的方法步骤参照文献[18]。转化子在含有氯嘧磺隆(100 μg/mL)的平板中进行筛选，提取抗性转化子的基因组，根据CgRGS2基因上游片段的上翼序列和下游片段的下翼序列分别设计引物CgRGS2UU和CgRGS2DD，并根据pCB1532靠近上下游片段的内部序列设计引物PI和PI1，利用3对引物(CgRGS2F+CgRGS2R、CgRGS2UU+PI、CgRGS2DD+PI1) (表 1)对转化子进行PCR鉴定，通过引物CgRGS2F+CgRGS2R无扩增条带而引物CgRGS2UU+PI、CgRGS2DD+PI1能扩增出目的条带的转化子为阳性转化子。
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| 图 1. CgRGS2基因敲除原理 Figure 1. Gene knockout principle of CgRGS2. |
以野生型基因组为模版，利用引物CgRGS2hbF和CgRGS2hbR扩增基因互补片段(包含CgRGS2基因上游1500 bp、基因编码区和下游500 bp)，将之与表达潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的DNA片段(来自质粒pCB1003)连接，然后克隆到pUC18上，得到互补载体pUC18-CgRGS2，以CgRGS2敲除突变体制备原生质体，原生质体转化方法同上，转化子在含潮霉素(300 μg/mL)的平板中进行筛选，提取抗性转化子的基因组，利用CgRGS2基因引物CgRGS2F和CgRGS2R进行PCR验证，能扩增出CgRGS2基因目的条带的为互补转化子。
1.4 突变体表型分析 1.4.1 营养生长及菌丝形态观察 胶孢炭疽菌野生型菌株、突变体及互补株于PDA平板上活化7 d后，用打孔器打取5 mm的菌饼分别接种于PDA、CM、CZAPEK和MM固体培养基中，28 ℃黑暗培养7 d。测量菌落生长直径并观察菌落形态特征，每处理设3个重复。菌丝形态观察是将野生型菌株、突变体及互补株于CM平板上活化4 d，打取5 mm菌饼接种于铺有CM培养基薄层的载玻片上，28 ℃培养2 d，显微镜观察并拍照。 1.4.2 分生孢子产量及萌发 菌株在PDA平板上28 ℃黑暗培养10 d左右，待菌丝体大致铺满平板后用无菌涂布棒轻轻将表面气生菌丝刮除，再转移至光照培养箱连续光照3 d诱导产孢，取10 mL含0.2%吐温80的无菌水冲洗平板，经灭菌的脱脂棉过滤至离心管，并用血球计数板对孢子计数，试验设3个重复，结果取平均值。滴加50 μL孢子悬浮液于干净的载玻片上，28 ℃黑暗保湿条件下诱导其萌发，统计孢子萌发率及附着孢形成率，试验设3个重复。 1.4.3 胁迫因子敏感性分析 野生型、突变体及互补株在PDA平板活化7 d，打取5 mm菌饼分别接种于含有NaCl (浓度分别为0、0.5、0.8、1.0 mol/L)、H2O2 (浓度分别为0、5、10、20 mmol/L)及0.01% SDS的MM平板上，28 ℃培养7 d后观察并拍照记录，计算抑制率，试验设3个重复。 1.4.4 致病性分析 选取无病斑、表面均匀光滑的芒果，用已灭菌的大头针在芒果表面形成伤口，于活化7 d的PDA平板上打取5 mm菌饼，分别以无伤口及伤口的方式接种芒果，28 ℃保湿培养，5 d后观察发病情况并记录。 2 结果和分析 2.1 基因的克隆及序列分析通过PCR扩增获得了CgRGS2基因的ORF框，生物信息学分析发现，CgRGS2基因ORF框全长1725 bp (GenBank登录号：KX180047)，编码1个574个氨基酸的蛋白，在蛋白质的N末端第22-157位氨基酸含有一个RGS功能域(图 2-A)。将CgRGS2在GenBank中利用BLASTp工具进行比对，选取13个来自不同真菌的RGS蛋白序列构建系统发育树(图 2-B)。CgRGS2与C. gloeosporioides Nara gc5的RGS蛋白(XP_007282783)相似度达到91%，此外CgRGS2与希金斯刺盘孢(C. higginsianum)、油菜黄萎菌(Verticillium longisporum)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces gramini)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)相关RGS蛋白的同源性较高，相似度在38%以上。
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| 图 2. CgRGS2蛋白结构域和系统进化树分析 Figure 2. Protein domain and phylogenetic tree analysis of CgRGS2. A: protein domain analysis of CgRGS2; B: phylogenetic tree analysis of CgRGS2. The phylogenetic tree was constructed by using Clustal X and MEGA 5.0 with homologous sequences of CgRGS2 from various strains, with their sequence IDs in the parentheses; the numbers on the horizontal lines represent evolutionary distances. |
2.2 CgRGS2基因的敲除与互补
将CgRGS2基因的敲除载体转化野生型原生质体，共获得164个转化子，利用3对引物CgRGS2F+CgRGS2R、CgRGS2UU+PI、PI1+CgRGS2DD (表 1)进行筛选，结果显示转化子27的CgRGS2F+CgRGS2R无法扩增出CgRGS2基因片段(图 3-A)，通过CgRGS2UU+PI、PI1+CgRGS2DD引物进行鉴定，分别能扩增出1500 bp左右的条带(图 3-B)，确定27号为阳性转化子，命名为ΔCgRGS2-27。
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| 图 3. CgRGS2基因的敲除和互补验证 Figure 3. Verification of CgRGS2 gene knockout and complementation. lane 1: PCR amplification result using primers CgRGS2F and CgRGS2R of wild type; lane 2: PCR amplification result using primers CgRGS2F and CgRGS2R of ΔCgRGS2-27; lane 3: PCR amplification result using primers CgRGS2UU and PI of wild type; lane 4: PCR amplification result using primers PI1 and CgRGS2DD of wild type; lane 5: PCR amplification result using primers CgRGS2UU and PI of ΔCgRGS2-27; lane 6: PCR amplification result using primers PI1 and CgRGS2DD of ΔCgRGS2-27; lane 7: PCR amplification result using primers CgRGS2F and CgRGS2R of wild type; lane 8: PCR amplification result using primers CgRGS2F and CgRGS2R of ΔCgRGS2-27; lane 9: PCR amplification result using primers CgRGS2F and CgRGS2R of ΔCgRGS2/rgs2; M: DL2000 DNA marker. |
将互补载体pUC18-CgRGS2转化敲除突变体ΔCgRGS2-27的原生质体，在含潮霉素的平板上进行筛选，共获得48个抗性转化子，通过PCR验证，发现转化子31号能够扩增出CgRGS2基因片段(图 3-C)，确定为互补转化子，将该互补株命名为ΔCgRGS2/rgs2。
2.3 突变体表型分析 2.3.1 CgRGS2影响胶孢炭疽菌的营养生长 将野生型菌株、敲除突变体ΔCgRGS2-27及互补株分别接种到不同培养基上观察其生长情况，结果见图 4。在不同培养基上，ΔCgRGS2-27较野生型及互补株生长缓慢，尤其在营养较贫瘠的MM培养基上，野生型菌株培养7 d的平均直径为6.0 cm，而突变体的菌落直径仅为3.4 cm，约为野生型菌株的56%，互补株的生长速率与野生型相似。由此可见，CgRGS2参与调控胶孢炭疽菌的营养生长。
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| 图 4. 菌株在4种培养基上生长情况比较 Figure 4. Comparison of the growth on 4 media of strains. |
菌株在CM平板上活化4 d后，打取5 mm菌饼接种于铺有CM培养基的载玻片上，2 d后显微镜观察显示敲除突变体ΔCgRGS2-27气生菌丝较浓厚茂密，而野生型菌株和互补菌株菌落边缘较稀疏(图 5)，推测CgRGS2可能参与调控气生菌丝的生长。
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| 图 5. 野生型、ΔCgRGS2-27与互补株菌落边缘形态比较 Figure 5. Comparison of colony edge between wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain. |
2.3.2 CgRGS2参与调控分生孢子产量及萌发 通过血球计数板计数，发现ΔCgRGS2-27的产孢量与野生型相比有显著差异，野生型菌株分生孢子浓度平均为8.05×106个/mL，ΔCgRGS2-27分生孢子浓度为3.85×105个/mL，仅为野生型的1/20。同时野生型菌株分生孢子多为单端或双端萌发，而ΔCgRGS2-27的分生孢子呈现多端萌发现象，且12 h后大部分芽管膨大粗壮，分支增多(图 6)。ΔCgRGS2-27分生孢子萌发率和附着胞形成率同野生型及互补株相比无显著差异。可见，CgRGS2参与调控分生孢子的产量及萌发。
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| 图 6. 野生型菌株、ΔCgRGS2-27与互补菌株分生孢子萌发形态 Figure 6. Conidium germination morphology of wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain. A: appressorium; gt: germ tube; C: conidium. |
2.3.3 CgRGS2参与调控氧化应激反应与细胞壁完整性 在MM培养基中加入NaCl、H2O2及SDS等胁迫因子，比较野生型菌株、突变体菌株及互补株在生长上的差异。试验结果表明，三者在含不同NaCl浓度的培养基上生长均受到不同程度的抑制，计算抑制率发现三者无显著差异(图 7-A)；在H2O2试验中，随着H2O2浓度的增大，ΔCgRGS2-27相较于野生型及互补株对H2O2更加敏感，如20 mmol/L H2O2下，野生型菌株的生长抑制率为38.2%，互补株抑制率为40.8%，而ΔCgRGS2-27的生长几乎完全受到抑制(图 7-B)；在含0.01% SDS的平板上，突变体菌株生长抑制率约为野生型菌株的两倍，差异显著(图 7-C)。由此可见，CgRGS2可能参与调控胶孢炭疽菌氧化应激反应与细胞壁完整性。
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| 图 7. 胁迫因子对野生型、ΔCgRGS2-27及互补株生长的影响 Figure 7. Effects of stress factors on the growth of wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain. A: effect of NaCl on the growth of wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain; B: effect of H2O2 on the growth of wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain; C: effect of SDS on the growth of wild type, ΔCgRGS2-27 and complementary strain; a, b, c: significant level, P < 0.05. |
2.3.4 致病性 将野生型菌株、ΔCgRGS2-27和互补株接种芒果，观察致病效果。由图所示，以无伤口方式接种，ΔCgRGS2-27几乎不形成病斑；而以伤口方式接种时，ΔCgRGS2-27形成的病斑明显小于野生型菌株和互补株(图 8)。由此可见，CgRGS2影响胶孢炭疽菌的致病性，其敲除突变体致病力减弱。
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| 图 8. 野生型菌株、ΔCgRGS2-27与ΔCgRGS2/rgs2致病性试验 Figure 8. Pathogenicity test of wild type, ΔCgRGS2-27 and ΔCgRGS2/rgs2. 1: no wound inoculation; 2: wound inoculation. |
3 讨论
G蛋白信号途径在真菌营养生长、产孢、侵染相关结构的分化及致病过程中扮演重要角色[19-20]。RGS蛋白作为G蛋白的负调控因子，在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。本研究成功获得了胶孢炭疽菌CgRGS2基因的敲除突变体及互补株，表型分析发现，敲除突变体在4种培养基上表现为营养生长缓慢，在MM培养基上尤为明显，推测是因为MM培养基营养最为贫瘠，使突变体在营养生长上的缺陷表现的更为突出；CgRGS2参与调控分生孢子的产量及萌发，其敲除突变体的分生孢子产量明显低于野生型菌株，在孢子萌发上也表现出差异；胁迫因子敏感性试验发现敲除突变体对H2O2更加敏感，对SDS的耐受力明显低于野生型菌株，说明CgRGS2参与调控胶孢炭疽菌的氧化应激反应，并可能引起细胞壁完整性的改变；致病性试验发现，敲除突变体的致病力明显低于野生型菌株，我们推测突变体营养生长缓慢，孢子产量减少以及氧化应激反应减弱可能是导致其致病性减弱的主要原因。以上表型缺陷在互补株中都能得到较好的恢复，由此可见CgRGS2蛋白参与调控胶孢炭疽菌的营养生长，分生孢子产量及萌发，氧化应激反应，细胞壁完整性及致病性等多个方面。
与其他植物病原真菌RGS蛋白的功能相比，胶孢炭疽菌CgRGS2的功能在很多方面有相似之处，如稻瘟病菌RGS蛋白参与调控该病菌的营养生长、细胞壁完整性、气生菌丝疏水性、有性/无性产孢、附着胞分化和侵染菌丝的生长等生理过程，其中MoRGS2参与调控无性产孢，芽管的生长和附着胞的形成，并且通过负调控Gα亚基影响该病菌的致病性[16]。在G. zeae中，RGS蛋白在营养生长、分生孢子形成、毒素产生、有性生殖及致病等过程中发挥着不同的作用，其中CgRGS2的同源蛋白FgFlbB参与营养菌丝的生长、并影响分生孢子的产量及孢子形态[11]；Fusarium verticillioides中RGS蛋白参与调控病原菌分生孢子发生及毒素合成等生命过程[15]。
本研究中，CgRGS2与胶孢炭疽菌的致病性相关，是该病菌的一个致病因子。目前，多个与胶孢炭疽菌致病相关的基因得到鉴定。胶孢炭疽菌在侵染过程中，与分生孢子中氨的生成、运输及分泌相关的基因gdh2、AMET、GLT、MEPB，在附着胞的形成及致病过程中起着重要作用[21-22]；PacC作为一个重要的pH调控的转录因子，调控大量在碱性条件下表达的基因，其中多个基因与致病性相关[23-24]。MAPK途径中CgMEK1基因影响到细胞分裂的极化及芽管的分化，其突变体不能形成附着胞，完全丧失致病性[25]；Cgl-slt2基因影响到营养菌丝生长及附着胞的形成，其突变体附着胞形成率显著下降，且丧失致病性[2]。cAMP-PKA途径中CgPKAC基因得到鉴定，其突变体附着胞形成被延迟，且在疏水表面的附着能力减弱，致病性也减弱[26]。Cgctr2基因调节细胞内铜离子平衡，其突变体表现出孢子萌发率降低，致病性减弱[27]。CgOpt1基因沉默突变体可以阻断生长素(IAA)诱导的发育过程，与野生型相比产孢量减少，黑色素减少，致病性也减弱[28]。总的来说，目前关于胶孢炭疽菌致病的分子机理研究尚处于起步阶段，至今还未有关于胶孢炭疽菌G蛋白信号途径中RGS蛋白功能的研究，本研究为胶孢炭疽菌分子致病机理的研究奠定了一定的基础。
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