微生物学报  2015, Vol. 55 Issue (4): 476-483
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20140322
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
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文章信息

王琳琳, 王颖芳, 段广才, 薛泽润, 郭向娇, 王鹏飞, 郗园林, 杨海燕. 2015
Linlin Wang, Yingfang Wang, Guangcai Duan, Zerun Xue, Xiangjiao Guo, Pengfei Wang, Yuanlin Xi, Haiyan Yang. 2015
志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系
Detection of CRISPR and its relationship to drug resistance in Shigella
微生物学报, 201555(4): 476-483
Acta Microbiologica Sinica, 201555(4): 476-483

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收稿日期：2014-06-22
修回日期：2014-10-13
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引用本文
王琳琳, 王颖芳, 段广才, 薛泽润, 郭向娇, 王鹏飞, 郗园林, 杨海燕. 志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系[J]. 微生物学报,2015, 55(4): 476-483.
Linlin Wang, Yingfang Wang, Guangcai Duan, Zerun Xue, Xiangjiao Guo, Pengfei Wang, Yuanlin Xi, Haiyan Yang. 2015. Detection of CRISPR and its relationship to drug resistance in Shigella[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2015, 55(4): 476-483.
志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系
王琳琳1, 王颖芳2, 段广才1, 3 , 薛泽润1, 郭向娇1, 王鹏飞1, 郗园林1, 杨海燕1    
1. 郑州大学公共卫生学院流行病教研室，河南 郑州 450001
2. 河南科技大学预防医学教研室，河南 洛阳 471003
3. 新乡医学院分子诊断与医学检验技术河南省协同创新中心，河南 新乡 453003
收稿日期: 2014-06-22; 修回日期: 2014-10-13
资助课题: 国家科技重大专项(2013ZX10004607)
作者简介: 王琳琳 (1990-)，女，河南省开封人，硕士研究生，研究方向为分子流行病学。
通讯作者: 段广才, Tel: +86-371-67781964; E-mail: gcduan@zzu.edu.cn
摘要: 【目的】 检测志贺菌成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)，并分析其与志贺菌耐药的关系。【方法】 根据CRISPR DB数据库公布的志贺菌确定的CRISPR结构序列CRISPR-S2、CRISPR-S4 和可能的CRISPR结构序列CRISPR-S1、CRISPR-S3设计四对引物，对60株志贺菌进行PCR扩增。采用CRISPR Finder分析CRISPR，采用改良K-B药敏纸片法检测志贺菌耐药情况，并分析CRISPR-S4与耐药的关系。【结果】 确定的CRISPR结构的总阳性率为95%，四个CRISPR位点组成12种CRISPR谱型(A-L)，除K型外均含确定的CRISPR结构，新发现1种重复序列和12种间隔序列。60株志贺菌的多重耐药率为53.33%。CRISPR-S4阳性菌株与阴性菌株之间，耐药的分布差异无统计学意义，但多重耐药菌株和耐TE菌株CRISPR-S4的重复序列多为R4.1，其3′末端缺失碱基AC；多重耐药菌株CRISPR-S4的间隔序列多为Sp5.1、Sp6.1和Sp7。【结论】 CRISPR在志贺菌中广泛分布。CRISPR重复序列的变异和间隔序列的多样性可能与志贺菌耐药有关。
关键词: 志贺菌    多重耐药    CRISPR    
Detection of CRISPR and its relationship to drug resistance in Shigella
Linlin Wang1, Yingfang Wang2, Guangcai Duan1, 3 , Zerun Xue1, Xiangjiao Guo1, Pengfei Wang1, Yuanlin Xi1, Haiyan Yang1    
1 Department of Epidemiology, College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
2 Department of Preventive Medicine, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan Province, China
3 Henan Innovition Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China
Foundation Item：Supported by Important National Science & Technology Major Projects of China (2013ZX10004607)
Corresponding author：Guangcai Duan, Tel: +86-371-67781964; E-mail: gcduan@zzu.edu.cn
Received: 22 June 2014/ Revised: 13 October 2014
Abstract:[Objective] To detect clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in Shigella, and to analyze its relationship to drug resistance. [Methods] Four pairs of primers were used for the detection of convincing CRISPR structures CRISPR-S2 and CRISPR-S4, questionable CRISPR structures CRISPR-S1 and CRISPR-S3 in 60 Shigella strains. All primers were designed using sequences in CRISPR database. CRISPR Finder was used to analyze CRISPR and susceptibilities of Shigella strains were tested by agar diffusion method. Furthermore, we analyzed the relationship between drug resistance and CRISPR-S4. [Results] The positive rate of convincing CRISPR structures was 95%. The four CRISPR loci formed 12 spectral patterns (A-L), all of which contained convincing CRISPR structures except type K. We found one new repeat and 12 new spacers. The multi-drug resistance rate was 53.33%. We found no significant difference between CRISPR-S4 and drug resistant. However, the repeat sequence of CRISPR-S4 in multi- or TE-resistance strains was mainly R4.1 with AC deletions in the 3′ end, and the spacer sequences of CRISPR-S4 in multi-drug resistance strains were mainly Sp5.1, Sp6.1 and Sp7. [Conclusion] CRISPR was common in Shigella. Variations of repeat sequences and diversities of spacer sequences might be related to drug resistance in Shigella.
Key words: Shigella    multi-drug resistance    CRISPR    

志贺菌属是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体，菌痢是全球流行的传染病，至今仍是影响人类健康的主要肠道传染病之一，是全球所面临的重要公共卫生问题[1]。随着抗生素的广泛使用甚至滥用，志贺菌频繁变异产生耐药株，多重耐药志贺菌株不断出现，给细菌性痢疾的防治带来新的挑战[2]。

近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)广泛分布于细菌和古细菌中，CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列构成的R-S结构组成，其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPR associated,cas)组成CRISPR/cas系统，为原核生物提供对噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力，从而抵抗噬菌体感染，限制基因的水平转移(HGT)[3, 4]。耐药基因的水平转移是细菌耐药性产生的主要原因[5]，目前有关CRISPR在原核生物中的功能及应用受到广泛关注，如细菌分型[6]、细菌进化分析[7]、抵御噬菌体[8]及Cas9介导的基因定点编辑技术[9]等，但其与细菌耐药关系的研究较少，且不同细菌中CRISPR与耐药的关系不一致，研究表明CRISPR/cas系统与肠球菌获得性耐药关系相反[10, 11]，即使CRISPR存在，耐药质粒仍可在大肠杆菌间传播[12]。本研究通过检测志贺菌中的CRISPR及各菌株的耐药情况，探讨志贺菌CRISPR的结构及分布与耐药的关系，为进一步阐明CRISPR的功能以及其对细菌耐药的影响提供参考依据。

1 材料和方法 1.1 菌株

临床分离的志贺菌60株，1996年分离自江西6株，1999-2001、2003-2013年分离自河南48株，2013年分离自北京市5株，2004年购于中国药检所1株，其中，45株为福氏志贺菌，13株为宋内志贺菌，2株为痢疾志贺菌；药敏试验标准控制菌：大肠埃希菌ATCC 25922，购自中国普通微生物菌种管理保藏中心。

1.2 药品和试剂

药敏纸片氨苄西林(Ampicillin,AM)、头孢噻吩(Cephalothin,CF)、四环素(Tetracycline,TE)、复方新诺明(Trimethoprim/sulfamethoxazole,SXT)、氯霉素(Chloramphenicol,Cl)及诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)购自杭州天和微生物试剂有限公司，聚合酶链反应(PCR)相关试剂、100 bp DNA Ladder购自上海生工生物工程股份有限公司，细菌基因组DNA 提取试剂盒购于上海莱枫生物科技有限公司，MH(A)培养基购于北京奥博星生物技术有限责任公司，酵母浸粉、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，琼脂粉购自Sigma公司。其余常规试剂均为国产分析纯级。

1.3 CRISPR检测

根据CRISPR DB数据库公布的志贺菌确定的CRISPR结构序列CRISPR-S2、CRISPR-S4 和可能的CRISPR结构序列CRISPR-S1、CRISPR-S3设计引物(引物序列见表1)，其中，CRISPR-S4与cas基因组成CRISPR/cas系统，CRISPR-S1、CRISPR-S2和CRISPR-S3均为孤立位点。

表 1. CRISPR的引物序列 Table 1. Primers of CRISPR for PCR Amplification
GenePrimerSequence (5′→3′)PCR products /bpAnnealing temperature /℃
CRISPR-S1S1FATTAGTCGGCGTAAGAAAGA60956
S1RGAACAGCGTGATTATGGATGC
CRISPR-S2S2FTTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG71556
S2RGCGAAGAGAAAGAACGAGTA
CRISPR-S3S3FATCTCTGCTAACACCAACTAC71156
S3RCTACGACCCTGAATGGAATC
CRISPR-S4S4FAGCGACTAACTGGAAT CTTG65156
S4RCAATCTG GCTACTGGAAGTG
表选项

以试剂盒提取的志贺菌基因组DNA为模板，对志贺菌的CRISPR进行扩增和序列测定。扩增体系为50 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL，5 pmol/μL正、反向引物各1 μL，200-300 μg/mL模板DNA 4 μL。CRISPR反应条件均为：94℃预变性5 min；94℃变性60 s，51℃退火60 s，72℃延伸60 s，32个循环；72℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察并记录结果。CRISPR的扩增产物送上海生物工程股份有限公司测序，利用CRISPR Finder，分析CRISPR的重复和间隔序列，确认CRISPR的存在和结构，并利用序列比对软件ClustalX 2.1比较各CRISPR位点的重复序列和间隔序列。

1.4 药敏试验

采用改良Kirby-Bauer(K-B)法进行药敏试验，参照临床和实验室标准化研究所(CLSI)指南进行[13]，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。分析志贺菌对不同药物的耐药分布情况，对3种及以上不同种类抗生素耐药的细菌为多重耐药菌。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0 统计软件处理数据，CRISPR与耐药的分布采用x2检验或Fisher’s确切概率检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 60株志贺菌CRISPR的分布和结构 2.1.1     CRISPR的检测结果：以60株志贺菌基因组DNA为模板，PCR扩增CRISPR-S1、 CRISPR-S2、CRISPR-S3和 CRISPR-S4，采用CRISPR Finder查找分析CRISPR，结果见表2，含3个及以上spacer的CRISPR位点检出率为31.67%。

表 2. 60株志贺菌CRISPR的检出率和间隔序列数目 Table 2. The positive rate and spacer number of CRISPR in 60 Shigella strains
Gene Spacer number Strain number Percentage /%
CRISPR-S1 1 20 33.33
CRISPR-S21151.67
230
CRISPR-S3148 80
CRISPR-S422573.33
318
91
表选项
2.1.2     60株志贺菌CRISPR的分布：60株志贺菌中，每株至少含有1个CRISPR位点，组成了12种CRISPR谱型(A-L，表3)，最常见的是B型，其次为F型。3株志贺菌的CRISPR谱型为K型，只含一个可能的CRISPR结构CRISPR-S3，其余57株志贺菌的CRISPR谱型均含确定的CRISPR结构CRISPR-S2或CRISPR-S4，确定的CRISPR结构的总阳性率为95%。

表 3. 60株志贺菌CRISPR的分布 Table 3. Distribution of CRISPR in 60 Shigella strains
Type CRISPR spectral pattern Strain number Percentage /%
A CRISPR-S1+CRISPR-S2+CRISPR-S3+CRISPR-S4 4 6.67
B CRISPR-S2+ CRISPR-S3+ CRISPR-S4 12 20
C CRISPR-S1+ CRISPR-S3+ CRISPR-S4 9 15
D CRISPR-S1+ CRISPR-S2+ CRISPR-S3 1 1.67
E CRISPR-S1+ CRISPR-S2+ CRISPR-S4 1 1.67
F CRISPR-S2+ CRISPR-S3 11 18.34
G CRISPR-S2 + CRISPR-S4 1 1.67
H CRISPR-S3+ CRISPR-S4 8 13.32
I CRISPR-S1+ CRISPR-S4 5 8.32
J CRISPR-S2 1 1.67
K CRISPR-S3 3 5
L CRISPR-S4 4 6.67
表选项
2.1.3     CRISPR的重复序列：CRISPR Finder识别到的重复序列共9种，R3.2为新发现的重复序列，其他8种重复序列与CRISPR DB数据库中公布的一致，部分存在变异(图1)。3株志贺菌CRISPR-S1的重复序列为R1.2，其3′末端缺失碱基AGC；1株志贺菌CRISPR-S2的重复序列为R2.2，其5′端缺失碱基GTTCA，并发生一个A到G的突变，1株志贺菌CRISPR-S2的重复序列为R2.3，其3′端缺失碱基TAAAAAT；2株志贺菌CRISPR-S3的重复序列为R3.2，它与R3.1的同源性很低；25株志贺菌CRISPR-S4的重复序列为R4.1，其3′端缺失碱基AC。

图 1. CRISPR的重复序列比对 Figure 1. Sequence alignment of CRISPR repeats. Figures in bracket represented the number of strains with corresponding repeat. “*” represented perfect match, “:” represented strong similarity, “.” represented weak similarity.
图选项
2.1.4     CRISPR的间隔序列：CRISPR Finder识别到的间隔序列共242条，包括23种不同类型的间隔序列，其中12种为新发现的间隔序列，共30条，11种为CRISPR DB 数据库中已公布的，共212条。同一CRISPR位点的间隔序列存在差异(图2)。可能的CRISPR结构CRISPR-S1和CRISPR-S3的间隔序列比较单一，3株志贺菌CRISPR-S1的间隔序列为Sp1.2，其5′端缺失碱基GGC，2株志贺菌CRISPR-S3的间隔序列为Sp4.2，其与Sp4.1同源性较低，为新发现的间隔序列；孤立的CRISPR位点CRISPR-S2的间隔序列亦比较单一，1株志贺菌CRISPR-S2的间隔序列为Sp2.2和Sp3.2，均在3′末端缺失碱基GTTCA，1株中发现新的间隔序列Sp2.3；与cas基因连接形成CRISPR/cas系统的CRISPR-S4，其间隔序列比较丰富，间隔序列之间的同源性较低，Sp7.1为新发现的间隔序列，1株志贺菌的CRISPR-S4含9个间隔序列Sp5.3、 Sp6.3、 Sp7.2、 Sp8、 Sp9、Sp10、 Sp11、 Sp12和Sp13，均为新发现的间隔序列。

图 2. CRISPR的间隔序列比对 Figure 2. Sequence alignment of CRISPR spacers. Figures in bracket represented the number of strains with corresponding spacer. “*” represented perfect match, “:” represented strong similarity, “.” represented weak similarity.
图选项
2.1.5     CRISPR的结构：重复序列的变化引起相邻间隔序列的变化，9种重复序列和23种间隔序列组成的CRISPR及可能的CRISPR结构在60株志贺菌中的分布见图3。在12种CRISPR谱型A到L中，由于同一CRISPR位点的重复和间隔序列在不同菌株间的差异，A、B、C、H、I及L型又包括不同的亚型。3株志贺菌的CRISPR-S1为CRISPR-S1.2，组成A-2、C-3和I-2亚型；1株志贺菌的CRISPR-S2为CRISPR-S2.2，组成B-4亚型，另1株志贺菌的为CRISPR-S2.3，组成B-3亚型；2株志贺菌的CRISPR-S3为CRISPR-S3.2，组成B-4和B-5亚型；18株志贺菌的CRISPR-S4为CRISPR-S4.2，组成A-2、B-2、B-4、B-5、C-2、C-3、H-2、I-1、I-2和L-2亚型，1株志贺菌的为CRISPR-S4.3，组成B-6亚型。

图 3. 60株志贺菌CRISPR的结构 Figure 3. The CRISPR structures in the 60 Shigella strains A→L represented the 12 CRISPR spectral patterns. Figures in bracket represented the number of strains with corresponding CRISPR spectral pattern. Rhombus represented new spacers found in this study. Two different layouts of repeat and spacer sequences existed in CRISPR-S1 (S1.1, S1.2) and CRISPR-S3 (S3.1, 3.2) respectively, three different layouts in CRISPR-S2 (S2.1, S2.2, S2.3) and CRISPR-S4 (S4.1, S4.2, S4.3) respectively.
图选项
2.2 60株志贺菌的耐药性

60株志贺菌对所检测的6种抗生素的耐药率如下：AM 为56.67%，CF为26.67%，TE为66.67%，SXT为65%，C为48.33%，NOR为16.67%。其中，对6种抗生素均不耐药的志贺菌8株，仅耐1种抗生素的志贺菌11株，耐2种抗生素的志贺菌9株，3种及以上耐药的多重耐药菌32株，多重耐药率为53.33%。

对6种抗生素均不耐药的志贺菌株的CRISPR谱型多为C型，多重耐药志贺菌株的CRISPR谱型多为B型、F型和H型(表4)。

表 4. 60株志贺菌CRISPR及耐药的分布 Table 4. Distribution of CRISPR and drug resistance in 60 Shigella strains
Drug
resistance		 CRISPR spectral pattern Total
A B C D E F G H I J K L
none 0 2 5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 8
single 1 2 0 0 0 2 0 2 3 0 1 0 11
two 2 1 2 0 0 0 0 0 2 1 0 1 9
multi 1 7 2 1 1 9 1 6 0 0 1 3 32
total 4 12 9 1 1 11 1 8 5 1 3 4 60
表选项
2.3 CRISPR-S4与耐药的关系

CRISPR-S4 阳性志贺菌株与阴性志贺菌株之间，多重耐药的分布差异无统计学意义，TE耐药性的分布差异亦无统计学意义，见表5。

表 5. 志贺菌CRISPR-S4与耐药性的关系 Table 5. The relationship between CRISPR-S4 and drug resistance in Shigella
* Fisher’s exact text; S: sensitivity, I: intermediated resistance, R: resistance.
Drug
resistance		 CRISPR-S4 Repeat Sp5 Sp6 Sp7
- + P - R4.1 R4.2 P - Sp5.1 Sp5.2 Sp5.3 P - Sp6.1 Sp6.2 Sp6.3 P - Sp7.1 Sp7.2 P
Antibiotics
Type		 none 1 7 0.361 1 4 3 0.034 1 4 2 1 0.022* 1 4 2 1 0.022* 5 2 1 0.008*
single 3 8 3 1 7 3 1 7 0 3 1 7 0 4 7 0
Two 1 8 1 4 4 1 4 4 0 1 4 4 0 5 4 0
MDR 11 21 11 16 5 11 16 5 0 11 16 5 0 27 5 0
TE S 4 15 0.667* 4 5 10 0.039* 4 5 9 1 0.052* 4 5 9 1 0.052* 9 9 1 0.015*
I 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0
R 12 28 12 20 8 12 20 8 0 12 20 8 0 32 8 0
表选项

CRISPR-S4 的重复序列与多重耐药的分布差异有统计学意义，与TE耐药性的分布差异亦有统计学意义。多重耐药志贺菌株和耐TE志贺菌株CRISPR-S4的重复序列多为R4.1。

CRISPR-S4 的间隔序列Sp5、Sp6、Sp7与多重耐药的分布差异有统计学意义，Sp7与TE耐药性的分布差异亦有统计学意义。多重耐药志贺菌株CRISPR-S4的间隔序列多为Sp5.1和Sp6.1，多重耐药志贺菌株和耐TE志贺菌株大多无Sp7。CRISPR-S4的间隔序列Sp8到Sp13，与Sp5.3、Sp6.3及Sp7.2同在1株志贺菌中存在，该志贺菌株对6种抗生素均不耐药。

CRISPR-S4 阳性志贺菌株与阴性志贺菌株之间，AM、CF、SXT、Cl和NOR耐药性的分布差异均无统计学意义；CRISPR-S4 的重复序列与AM、CF、SXT、Cl和NOR耐药性的分布差异均无统计学意义；CRISPR-S4 的间隔序列Sp5、Sp6、Sp7，与AM,CF,SXT,Cl和NOR耐药性的分布差异均无统计学意义。

3 讨论

1996年志贺菌被WHO认定为给人类带来巨大威胁、耐药性日渐增长的菌株[14]。随着抗生素的滥用，志贺菌不断变异产生耐药株，甚至多重耐药株。我们对60株志贺菌的耐药情况进行检测，发现志贺菌对AM、TE、SXT、C的耐药率较高，而对CF和NOR的耐药率较低，多重耐药率为53.33%，与任静朝等[15]报道结果一致。CRISPR广泛分布于细菌和古细菌的基因组中，本研究检测了60株志贺菌的可能的CRISPR结构CRISPR-S1、CRISPR-S3，及确定的CRISPR结构 CRISPR-S2、CRISPR-S4。4个CRISPR位点均被检出，它们形成了12种谱型(A-L)，除K型仅含可能的CRISPR结构CRISPR-S3，其他各型均含确定的CRISPR结构，确定的CRISPR结构的总阳性率为95%，与CRISPR DB数据库中公布的已测序的基因组中，81.82%志贺菌(9/11)和87.72%(5/57)的大肠杆菌中存在确定的CRISPR结构一致，与国内邓凯波在2株德氏乳杆菌和8株嗜热链球菌中均检测出CRISPR 位点结果一致[16, 17]，并且薛泽润等[18]在志贺菌中检测到CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。

CRISPR与cas基因组成CRISPR/cas系统，间隔序列靶向定位入侵的外源性基因，通过Cas蛋白将外源性基因裂解，从而限制基因的水平转移，抵抗噬菌体感染及质粒接合转移等[19]。而耐药基因的水平转移是志贺菌耐药的主要机制之一，目前有关CRISPR与耐药关系的报道在不同的细菌中尚不一致，Katie M.等[10]检测了粪肠球菌的CRISPR相关蛋白基因cas1和cas3，发现：cas1或cas3与多重耐药的获得关系相反，Kelli[11]分析粪肠球菌的CRISPR/cas，亦发现：CRISPR/cas与获得性耐药关系相反。但是，大肠杆菌的cas I-E在敏感株和耐药株间无差异，并且耐药质粒仍可以在CRISPR阳性大肠杆菌之间传播[12]。本研究中CRISPR-S1、CRISPR-S2、CRISPR-S3均为孤立位点，不与cas基因相连接，而CRISPR-S4与cas基因组成CRISPR/cas系统。因此，我们分析了CRISPR-S4与志贺菌多重耐药的分布，发现：虽然CRISPR-S4阳性菌株与阴性菌株之间，多重耐药的分布差异无统计学意义，但多重耐药志贺菌株的重复序列主要为R4.1，间隔序列主要为Sp5.1及Sp6.1。

同一CRISPR位点的重复序列相对保守，在同种细菌的不同菌株间高度相似，仅在少数菌株中发生变异[20]。本研究检测到的4个位点，仅3株志贺菌CRISPR-S1的重复序列、2株志贺菌CRISPR-S2的重复序列、2株志贺菌CRISPR-S3的重复序列和部分CRISPR-S4的重复序列发生变异。重复序列的变异并不是简单的碱基突变，重复序列的变化会引起紧邻的间隔序列的变化。间隔序列与CRISPR/cas系统发生免疫抑制作用密切相关，间隔序列可靶向定位入侵的外源性基因，而CRISPR/cas系统可获取入侵的外源基因的一段标志基因为新的间隔序列，从而抵御这一外源基因的再次侵入。本研究中发现多重耐药菌株缺乏Sp5.2,Sp5.3、Sp6.2、Sp6.3及Sp7，TE耐药菌株缺乏Sp7，Marraffini LA[21]发现CRISPR/cas系统的间隔序列与质粒切口酶同源，从而限制耐药基因的水平转移，提示Sp5.2、Sp5.3、Sp6.2、Sp6.3及Sp7可能与携带相应耐药基因的质粒同源。间隔序列的变异可导致免疫逃逸[22]，有趣的是，Bikard D等研究发现[23]，通过间隔序列变异甚至CRISPR的丢失，连接有耐药基因的前间隔序列(prospacer，间隔序列的同源基因序列)可逃逸CRISPR干扰，使肺炎链球菌获得相应的耐药基因。在志贺菌中，我们发现：CRISPR-S4阳性的多重耐药志贺菌株，其重复序列的3′末端缺失碱基AC，其后排列的间隔序列为Sp5.1和Sp6.1，而非Sp5.2、Sp5.3、Sp6.2、Sp6.3及Sp7，提示CRISPR尽管能限制外源性基因的侵入，在抗生素的选择性生存压力下，细菌的CRISPR可能发生变异，使细菌获得外源性耐药基因而存活下来，CRISPR重复序列的变异和间隔序列的多样性可能与志贺菌耐药有关。

参考文献
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