青藏高原独特的环境因素，使传统的商品化乳酸菌添加剂在青藏高原地区的应用受到了一定的限制。越来越多的学者希望能发掘青藏高原本土乳酸菌的特异性，并将其应用于当地的生产生活中。如热杰、原现军和Yuan分别对青藏高原燕麦(Avena sativa)、多年生黑麦草和青稞秸秆青贮品质进行了评价，发现青藏高原牧草青贮饲料色绿、酸香味浓、适口性好、有氧稳定性高，揭示青藏高原地区乳酸菌可能存在特异性^{[1, 2, 3]}。本课题组杨杨和高静对青藏高原藏嵩草(Koeleria tibetica)表面附着乳酸菌进行分离筛选，并发现由于长期生存在青藏高原特殊的环境中，高原地区乳酸菌具有更广泛的糖源利用特性^{[4, 5]}，但尚未有学者对青藏高原乳酸菌在低温条件下对牧草青贮发酵品质进行评价。

垂穗披碱草是一种青藏高原较常见的多年生禾本科牧草，它具有丰富的营养价值，适口性较好，是青藏高原地区可供家畜采食的典型优良牧草之一^{[6, 7]}。因此本研究以垂穗披碱草为青贮原料，以筛选出的在低温条件下生长较好的乳酸菌为添加剂进行青贮，然后探究乳酸菌在低温条件下对牧草青贮品质的影响，以期为发掘适合青藏高原高寒地区牧草青贮的乳酸菌菌种和青藏高原特殊环境条件下调制优质青贮饲料提供菌种资源和理论依据。

青贮原料为甘肃省天祝藏族自治县金强河地区(37°11′—7°13′N，102°23′—102°29′E，海拔2964 m)种植的垂穗披碱草，在初花期(2013年7月16日)收割。试验菌株为本课题组从青藏高原垂穗披碱草青贮饲料中分离并通过低温生长和发酵试验分离得到的戊糖片球菌PP-6，植物乳杆菌LP-2和清酒乳杆菌LS-5。相应的参考菌株为购自中国工业微生物网(CICC)并分离自低海拔地区青贮饲料中的戊糖片球菌C-PP(编号：CICC22734)，植物乳杆菌C-LP(编号：CICC21864)和清酒乳杆菌C-LS(编号：CICC21858)，以及从商品化乳酸菌制剂CNR Stage II(Vita Plus Corporation，美国)分离得到的植物乳杆菌A-LP和戊糖片球菌A-PP。以上总共8个菌种供以下实验。

本实验中乳酸菌添加青贮制作分两组，一组为实验筛选得到的清酒乳杆菌LS-5与其对应的购自中国工业微生物网(CICC)的标准菌C-LS作为添加菌进行青贮发酵。另一组为戊糖片球菌PP-6，植物乳杆菌LP-2作为混合添加剂进行青贮发酵，对应的标准菌株为购自中国工业微生物网(CICC)的戊糖片球菌C-PP和植物乳杆菌C-LP以及从美国乳酸菌制剂分离得到的植物乳杆菌A-LP和戊糖片球菌A-PP，对应菌株分别作为混合添加剂进行青贮发酵实验。

采集垂穗披碱草，切短至2 cm左右后混匀，室温自然风干24 h左右，获取含水量为65%-70%的青贮原料，称取200 g，分别按10⁶ CFU/g FM的接种量喷洒乳酸菌菌液，混匀后装入(30 cm×23 cm)的聚乙烯袋中，用真空包装机将其抽真空并封口，分别于15 ℃和25 ℃恒温培养箱中进行青贮，青贮50 d后开启，取样分析青贮料发酵品质和化学成分。

取青贮原料和样品各10 g，加入90 mL去离子水并搅拌均匀，用组织捣碎机将其搅碎l min，然后用4层纱布过滤，滤出草渣得到的浸出液放入-20 ℃条件下保存，用于pH值、氨态氮、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸、水溶性碳水化合物的测定。用pH计测定青贮料浸出液pH值；乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量用SHIMADZE-10A型高效液相色谱仪分析，色谱柱：ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column 300 mm×8 mm，检测器：SPD-M10AVP，流动相：3 mmol/L高氯酸，流速：1 mL/min，进样量：5μL，柱温：50 ℃，检测波长：210 nm^[8]；氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定^[9]；水溶性碳水化合物含量用蒽酮－硫酸比色法测定^[10]。剩余的青贮样品各自混匀后置于65 ℃鼓风干燥箱中烘干48 h左右直至恒重，测定其水分含量，烘干样品用微型植物样粉碎机粉碎后过40目筛用于干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定。干物质含量用105 ℃烘干法测定^[11]；粗蛋白含量用Tecator 1030型凯氏定氮仪蒸馏测定^[12]；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量用范氏洗涤纤维法测定^[13]。

基础数据利用Excel软件处理并制作图表，用SPSS软件进行方差分析与Duncan多重比较。

从表1可以看出，参考菌株和本课题组从青藏高原分离得到的试验菌株在糖发酵特性方面呈现较大差异。试验菌株植物乳杆菌LP-2发酵棉子糖但不发酵鼠李糖，而参考菌株A-LP、C-LP则发酵鼠李糖但不发酵棉子糖；试验菌株戊糖片球菌PP-6发酵棉子糖、乳糖、山梨醇、蜜二糖和蔗糖但不发酵鼠李糖，而参考菌株C-PP和A-PP则呈现出相反的变化，只有A-PP利用阿拉伯糖，而PP-6和C-PP则均不利用阿拉伯糖；试验菌株清酒乳杆菌LS-5可利用棉子糖、苦杏仁苷、鼠李糖、乳糖、山梨醇、木糖、阿拉伯糖、蜜二糖和蔗糖，而参考菌株C-LS则均不利用。

在不同温度和pH值环境下，对不同菌株的生长OD进行测定发现，在50 ℃时，实验室分离的LS-5只有微弱生长，而C-LS生长较好；LS-5与C-LS在pH值为3时不生长，而其余菌株均有微弱生长。

表2可以看出，垂穗披碱草青贮前原料水分含量在70%左右，水溶性碳水化合物含量为5.27%，基本满足了良好青贮的水分含量要求。

从表3和4可以看出，在15 ℃时，本课题组分离的试验菌株清酒乳杆菌LS与参考菌株C-LS相比能显著降低青贮料pH值、丙酸含量和氨态氮/全氮值(P<0.05)，且能够保存更多的水溶性碳水化合物和粗蛋白；在25 ℃时，pH值差异不显著，但本课题组分离的清酒乳杆菌LS与参考菌株C-LS相比,显著提高了青贮饲料乳酸含量(P<0.05)，且氨态氮/全氮值显著低于参考菌株C-LS处理组(P<0.05)，显著降低了青贮料中性洗涤纤维含量(P<0.05)。

青贮50 d后，所有处理青贮饲料水溶性碳水化合物含量均减少。从表5和6可以看出，在25 ℃时，青贮饲料中剩余的水溶性碳水化合物含量占青贮原料的17%左右，粗蛋白含量也低于青贮原料。试验菌株混合制剂LP+PP与参考菌株相比，在15 ℃下显著增加了青贮饲料乳酸含量(P<0.05)，且高于25 ℃处理，有较低的氨态氮/全氮值，能够保存更多的粗蛋白，显著降低了青贮料中性洗涤纤维含量(P<0.05)。

由于青贮体系中微生物的活动消耗了牧草中的水溶性碳水化合物，青贮后水溶性碳水化合物含量显著降低，与管武太等研究结果相一致^[15]。但从青藏高原分离的清酒乳杆菌LS-5与同种商品菌相比，pH值的降低抑制了腐败菌对水溶性碳水化合物的利用，使其青贮饲料中水溶性糖含量显著高于C-LS处理。植物蛋白酶自身的分解，丁酸菌与肠道菌的作用，使青贮料中粗蛋白含量降低^[16]。添加从青藏高原分离的清酒乳杆菌LS-5可使青贮饲料有较低的pH值，抑制了微生物对蛋白的分解，使青贮饲料能够保存更多的蛋白。中性洗涤纤维含量占垂穗披碱草干物质含量的63.29%，一般较难分解。在青贮饲料中一般通过添加纤维素酶，加大植物细胞壁的分解，降低中性洗涤纤维含量，提供更多的碳水化合物以促进发酵^[17]。本研究发现，从青藏高原分离得到的清酒乳杆菌LS-5在降低青贮料中性洗涤纤维含量方面有一定的优势。中性洗涤纤维含量下降，将不仅仅改善牧草的营养价值，也对提高家畜生产性能有一定的益处^[18]。

相对于常规条件下分离得到的商品化乳酸菌菌种，从青藏高原垂穗披碱草青贮饲料中分离并筛选得到的低温发酵高原乳酸菌菌种清酒乳杆菌LS-5、戊糖片球菌PP -6和植物乳杆菌LP -2在15 ℃下能有效提高垂穗披碱草青贮品质和营养价值。从青藏高原青贮饲料中分离得到的乡土乳酸菌菌种更适应在青藏高原的低温条件下调制优质青贮饲料。而且，与普通商品化乳酸菌菌种相比，从青藏高原特殊条件下分离得到的高原乳酸菌菌种可利用更多的碳源作为其发酵底物。