二氯喹啉酸，ISO通用名称：Quinclorac，CIPAC数字代号：439，分子式：C₁₀H₅C_l2NO₂，化学名称：3，7-二氯喹啉-8-羧酸(3,7-dichloroquinoline-8-carboxylic acid)；1984年由德国巴斯夫公司开发的激素类选择性稻田除草剂，商品名有神锄(1代、2代)、快杀稗、杀稗灵、稗草净、克稗星和稗草王等，能有效防除稻田大龄稗草而得到广泛推广使用^{[1, 2]}。二氯喹啉酸的大量使用减轻了田间工作量，但由于其在土壤中降解缓慢，易在土壤中残留积累给下茬作物造成药害，尤其对二氯喹啉酸敏感的十字花科、伞形花科和茄科作物等影响更为明显。张倩等人^[3]测得二氯喹啉酸在水稻田中的半衰期为35.6 d，陈泽鹏等人^{[4, 5]}的研究表明，在田间推荐使用量225-375 g.a.i/hm²，需经过269 d降解才能消除对烟株生长的影响。温度、湿度和pH值对二氯喹啉酸的降解有一定影响，光照对二氯喹啉酸的降解缓慢^{[6, 7]}二氯喹啉酸在土壤中的降解主要依靠酶和微生物^{[8, 9]}。目前针对二氯喹啉酸土壤中残留污染问题主要治理对策有物理吸附、深耕覆土、增施有机肥和化学药剂缓解药害等措施，但都不能从根本上解决二氯喹啉酸在土壤中的残留问题，所以亟待提出新的方法和措施来解决二氯喹啉酸残留污染问题，这也是该研究的目的所在。

目前我国科研工作者已从土壤中分离到几株具有二氯喹啉酸降解活性的菌株，如吕镇梅^{[10, 11, 12]}分离到两株降解菌，分别为苍白杆菌属(Ochrobactrum)的菌株LS和洋葱伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia cepecia)的菌株WZ1；董俊宇等人^[13]分离到一株产碱菌属(Alcaligenes)的菌株J3；徐淑霞等人^[14]分离到一株博德特氏菌属(Bordetella)的降解菌株HN36等；但目前国内尚无有关节杆菌属(Arthrobacter)二氯喹啉酸降解菌的报道。

本研究长期从事二氯喹啉酸降解菌的筛选工作并获得了一株对二氯喹啉酸有良好降解效果的节杆菌属降解菌MC-10，对其进行形态学、生理生化鉴定和分子生物学鉴定确定了其种属，测定了其降解效果并对影响其降解效果的因素进行了相关分析，并初步评价了该菌对土壤中二氯喹啉酸的降解效果。结果报道如下。

1.1.1 主要试剂和仪器：98.1%二氯喹啉酸标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；细菌DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)。Waters 2695 液相色谱仪-紫外检测器(HPLC-UV，美国Waters 公司)；BLUD PARDWSZ-200A 回旋式振荡器(上海一恒科技有限公司)；TD5A-WS 多管架自动平衡离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；离心机；PCR 仪；电泳仪；培养箱；摇床；超净台；JEM-1200EX透射电子显微镜。

1.1.2 土样：四川省西昌市常年施用二氯喹啉酸的稻田土(北纬27°51′0″，东经102°21′46″，海拔1590.3米)。

1.1.3 培养基：实验所用无机盐选择培养基和LB扩大培养基参照文献^[13]。

向50mg/L二氯喹啉酸无机盐培养基中加入5 g土样，于28℃、150 r/min的摇床上培养7 d，以5%的转接量转接到新的50 mg/L的二氯喹啉酸无机盐培养基中，连续富集培养4次。在含50 mg/L二氯喹啉酸的无机盐固体培养基上划线分离纯菌株，在35℃下培养48 h挑取生长势旺的单菌落于LB液体培养基中扩大培养，并保存于LB斜面待用。

1.3.1 形态学鉴定：将降解菌MC-10接种于固体LB培养基，35℃下培养48 h观察菌落形态并用电子显微镜观察菌体形态。

1.3.2 生理生化鉴定：生理生化鉴定采用单盒生化鉴定管并参照文献^[15]方法进行。

1.3.3 分子生物学鉴定：(1)采用细菌DNA提取试剂盒提取MC-10降解菌DNA，并以此为模板扩增降解菌的16S rDNA序列。用于扩增反应的引物为一对通用引物，上游引物：5-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3’(E.coli bases 8 to 27),下游引物：5’-TACCTTGTTACGATT-3’(E.coli bases 1507 to 1492)。(2)扩增反应体系(25 μL)：模板1 μL，dNTP(25 mmol/L)2 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，10xTaq缓冲液2.5 μL，超纯水15.7 μL。(3)PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 0.5 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30 次；72℃ 10 min。(4)PCR产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Transgenic)进行目的片段回收，回收产物测序工作由上海瀚宇生物科技有限公司完成。测序结果与GenBank数据库进行对比，并利用MEGA4.0软件构建降解菌MC-10系统发育树。

将待测菌接种于LB液体培养基中，28℃、150 r/min培养至对数中期(OD₆₀₀=1.5)，10000×g离心1 min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，重悬用于降解效果测定试验。

1.5.1 二氯喹啉酸浓度的测定：采用高效液相色谱法，并参照文献^[16]进行。

1.5.2 二氯喹啉酸降解试验：向20 mg/L二氯喹啉酸无机盐液体培养基中，以5%接种量接种初步筛得的12株降解菌，于28℃、150 r/min的摇床上培养7 d，每隔24 h分别测定一次二氯喹啉酸的质量浓度和菌株生长量(OD₆₀₀值)。对照组接种等量灭活的PBS菌悬液。

1.6.1 温度对降解菌降解效果影响：以5%接种量将MC-10 PBS菌悬液接种到20 mg/L、pH 7的二氯喹啉酸无机盐培养基中，分别置于25℃、28℃、30℃、33℃、35℃的摇床上培养4 d，测定各处理二氯喹啉酸浓度。

1.6.2 pH对降解菌降解效果的影响：分别配制pH为4、5、6、7、8、9的20 mg/L二氯喹啉酸无机盐培养基，并向各培养基中接种5%降解菌MC-10 PBS菌悬液，于28℃、150 r/min的摇床上培养4 d测定各处理二氯喹啉酸浓度。

1.6.3 接种量对降解效果的影响：分别以1%、3%、5%、7%、10%接种量将降解菌MC-10 PBS菌悬液接种到20 mg/L、pH 7的二氯喹啉酸无机盐培养基中，培养4 d测定各处理二氯喹啉酸浓度。

1.6.4 二氯喹啉酸初始浓度对降解效果的影响：将降解菌MC-10 PBS菌悬液以5%的接种量分别接种到10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的二氯喹啉酸无机盐培养基中，于28℃、150 r/min摇床上培养4 d后测定二氯喹啉酸浓度。

以混土法将二氯喹啉酸加入到灭活土壤中，配制最初沉积量为10 mg/kg的二氯喹啉酸毒土，将降解菌MC-10 PBS菌悬液以5%接种量均匀接种到二氯喹啉酸毒土中，对照组加等量灭活的MC-10 PBS菌悬液。于30℃培养箱中培养7 d，测定土壤中残留二氯喹啉酸的含量，测定过程参照文献^[3]进行。

从二氯喹啉酸无机盐筛选培养基中选取12株长势良好的菌株，分别将其接种到20 mg/L、pH 7二氯喹啉酸无机盐培养基中，在28℃、150 r/min摇床上培养7 d后测得各处理残留二氯喹啉酸浓度并计算各菌株降解率见表1。降解率=[(对照组残留浓度-处理组残留浓度)/初始浓度]×100%。从表1可以看出MC-10的降解效果较好可达90%，降解菌MC-10降解二氯喹啉酸的液相色谱分析图如图1。

图 1. 培养基中二氯喹啉酸液相色谱分析图 Figure 1. HPLC chromatograms of quinclorac in medium. A: HPLC chromatograms of quinclorac in the beginning; B: HPLC chromatograms of quinclorac after degraded 7 days by strain MC-10.

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菌株MC-10在LB固体培养基上培养48 h后，菌落呈黄色，边缘整齐，光滑湿润。电子显微镜下观察菌体呈短杆状，存在球杆形态转化，无鞭毛、不形成芽孢(图2)。革兰氏染色阳性，氧化酶甲基红试验均呈阴性，淀粉水解和吲哚试验呈阳性，能利用葡萄糖和乳糖。将菌株MC-10 16S rDNA序列上传到GenBank数据库中获得登录号为：KJ619485，并与GenBank中序列进行相似度比对，在RDP数据库中进行BLAST，应用MEGA 4.0软件作系统发育树(图3)，结合生理生化鉴定结果确定其为节杆菌属(Arthrobacter)菌株。菌株MC-10保存于中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC8489。

图 2. 降解菌MC-10透射电镜照片(40000×) Figure 2. TEM images of the strain MC-10 (40000×)

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图 3 以16S rDNA序列为基础的降解菌MC-10系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of the strain MC-10 based on 16S rDNA sequence The phylogenetic tree was constructed using the MEGA program with the neighbor-joining algorithm. In the parentheses are GenBank accession number. Number at each node is the percentage of nodes in 1 000 bootstrap replications. Bar, 0.5% sequence divergence.

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2.3.1 培养时间对MC-10降解效果的影响：将降解菌MC-10以5%接种量接种到二氯喹啉酸无机盐培养基中，前48 h为生长的延滞期，细菌数量增长缓慢，对二氯喹啉酸降解量较小；但细菌仍然很活跃，大量分泌各种酶类为之后的生长做准备，所以这个时期的二氯喹啉酸降解速率较小。第三天开始细菌生长进入对数期，细菌代谢旺盛，大量繁殖，对二氯喹啉酸的降解速率也大幅提升。随着细菌数量的增长，培养基中二氯喹啉酸的含量逐渐减少，不足以维持细菌大量繁殖的需要，细菌的生长量略有下降，直至培养基中二氯喹啉酸被降解完(图4)。

图 4. 培养时间对菌株MC-10生长量(0D600)和降解效果的影响 Figure 4. Effect of incubating time on the growth (0D600) and the degradation rate of the strain MC-10.

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2.3.2 温度对降解菌MC-10降解效果的影响：由图5可知，降解菌MC-10在25-35℃之间对二氯喹啉酸均有较好的降解效果，4 d降解率均能达到75%以上，说明该菌的有较好的环境适应能力，具有移植到田间自然环境中的良好潜质；从图5中还可以看出该菌对二氯喹啉酸的最佳降解温度为30℃，4 d降解率超过90%。

图 5 温度对菌株MC-10降解效果的影响图 Figure 5 Effect of temperature on the degradation rate of the strain MC-10.

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2.3.3 pH对降解菌MC-10降解效果的影响：由图6可以看出，该菌在pH 4-9范围内均能生存，在pH 6-7时降解效果最好，4 d降解率可达80%；随着pH增高或减小降解率也逐渐降低，但pH减小对菌株降解效果的影响要小于pH升高对菌株降解效果的影响，说明该菌适宜在中性或微酸性的环境中生长。出现这种现象的原因可能是因为二氯喹啉酸分子在酸性环境下以分子形式存在易穿过细胞膜，在碱性环境下则以离子形式存在，不易吸收利用。

图 6. pH值对降解菌MC-10降解效果的影响图 Figure 6. Effect of pH on the degradation rate of the strain MC-10.

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2.3.4 最初接种量对降解菌MC-10降解效果的影响： 从图7可以看出随接种量的增加降解率逐渐增大，菌株的生长量则随接种量的增加先升高后降低，是因为1%和3%接种量的处理经过4 d培养，菌量基数较小尚处于对数生长期，因而对二氯喹啉酸的降解量也偏小。接种量为5%、7%、10%处理组对二氯喹啉酸的降解率差别不明显是因为菌株经过4 d的培养都到达平稳期，经过了对二氯喹啉酸大量消耗的对数期；而10%接种量处理组的生长量则略有下降是因为菌落基数过大而提前进入衰退期，所以该菌的最佳接种量应在5%-7%之间。

图 7. 接种量对降解菌MC-10生长量(OD600)和降解效果的影响 Figure 7. Effect of inoculation quantity on the growth (OD600) and the degradation rate of the strain of MC-10

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2.3.5 二氯喹啉酸初始浓度对降解菌MC-10降解效果的影响：从图8可以看出降解菌MC-10在二氯喹啉酸初始浓度为10 mg/L-100 mg/L之间时均能较好的生长，当初始浓度在10 mg/L-50 mg/L之间时培养4 d，降解率达到80%；当二氯喹啉酸初始浓度超过80 mg/L时降解率逐渐降低，但也能达到60%以上。造成降解效率降低的原因，可能是二氯喹啉酸浓度过大开始对菌株产生毒害，也可能是二氯喹啉酸在水中溶解度较低，降解菌对未溶解的二氯喹啉酸利用效果较差，具体原因有待于进一步的分析研究。

图 8 二氯喹啉酸初始浓度对降解菌MC-10降解效果的影响 Figure 8 Effect of quinclorac concentration on the degradation rate of the strain MC-10

图选项

土壤中二氯喹啉酸最初沉积量为10 mg/L，在经过降解菌MC-10 7 d降解，土壤中残余二氯喹啉酸含量为1.76 mg/L (如图9-A)，对照组土壤中残余二氯喹啉酸含量为8.94 mg/L(如图9-B)，7 d降解率为71.8%，说明降解菌能够有效地降解土壤中残留二氯喹啉酸，具备移植到田间的潜质。

图 9 降解菌MC-10对土壤中二氯喹啉酸降解效果液相色谱分析对比图 Figure 9 Comparative of HPLC chromatogram between soil treated by the stain MC-10 and CK. A: HPLC chromatograms of quinclorac in the soil after degraded by strain MC-10; B: HPLC chromatograms of CK.

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二氯喹啉酸作为广泛使用的稻田除草剂，具有良好防治效果，减轻田间工作量，但由于其在土壤中降解缓慢易给下茬作物造成药害。为从根本上解决土壤中二氯喹啉酸残留问题，本研究从长期施用二氯喹啉酸的稻田土壤中分离到了一株二氯喹啉酸高效降解菌，经鉴定为节杆菌属菌并命名为MC-10。该降解菌最佳降解温度为30℃、最佳降解PH为7、最佳接种量为5%，二氯喹啉酸初始浓度在10-100 mg/L间均有良好的降解效果。将降解菌MC-10接种到10 mg/kg二氯喹啉酸毒土中，温室内培养7 d二氯喹啉酸降解率可达70%，降解菌MC-10在土壤中对二氯喹啉酸同样具有降解效果。

目前，针对二氯喹啉酸残留治理措施主要有田间施用生石灰中和二氯喹啉酸或活性炭吸附土壤中残留二氯喹啉酸^{[4, 17]}；喷施赤霉素、芸苔素内酯、植保素等化学药剂缓解受害烟株症状^{[18, 19]}；深耕覆土、增施有机肥等栽培措施改良土壤环境以减轻药害。这些措施虽然在一定程度上能缓解药害，但是不能从根本上解决二氯喹啉酸在土壤中的残留问题。为从根本上解决二氯喹啉酸在土壤中的残留问题国内学者从土壤中分离到了数株二氯喹啉酸高效降解菌，如菌株LS、菌株WZ1、菌株J3、菌株HN36等^{[10, 11, 12, 13, 14]}少数几株菌，有关节杆菌属二氯喹啉酸降解菌的报道尚属首次。二氯喹啉酸降解菌MC-10较上述几株降解菌具有较好的环境适应性，对低浓度下二氯喹啉酸同样具有良好的降解效果，具有较好的开发利用前景。

虽然降解菌MC-10在实验室环境下对水和土壤中的二氯喹啉酸具有较好的降解效果，但田间实际环境更为复杂，MC-10能否在田间有效地降解土壤中残留的二氯喹啉酸，减轻药害对下茬作物的影响还有待于进一步的试验研究。根据MC-10的生理生化特性，开发易于运输和施用的菌剂或菌肥用于土壤中残留二氯喹啉酸的治理是下一步研究工作的重点。目前，有关降解菌降解二氯喹啉酸作用机理的研究还很少，根据降解过程中的主要产物和最终产物推测反应过程，探索降解过程中起关键作用的酶和基因，将会更好地帮助我们治理二氯喹啉酸残留污染问题。