冻融联合灌注法优化大鼠肾脏脱细胞支架的制备
Optimization of preparation of rat kidney decellularized scaffold by combining freeze-thawing with perfusion
投稿时间:2018-07-01  
DOI:  10.13345/j.cjb.180272
中文关键词:组织工程,肾脏,脱细胞支架,冻融法,灌注法
英文关键词:tissue engineering, kidney, decellularized scaffolds, freeze-thawing, perfusion
基金项目:国家自然科学基金 (Nos. 81771566,81800618),重庆市留学人员回国创业创新支持计划 (No. cx2017015) 资助。
作者单位E-mail
胡东 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
张德迎 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014 dzdy199@126.com 
刘博 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
周宇 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
余熠杭 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
沈炼桔 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
龙春兰 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
刘星 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
林涛 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
何大维 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014  
魏光辉 重庆医科大学附属儿童医院 泌尿外科 儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室重庆 400014 u806806@cqmu.edu.cn 
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中文摘要:
      本研究旨在探索优化肾脏脱细胞支架的制备方法,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理研究提供实验基础。取大鼠肾脏灌注PBS作为对照组 (Control组),在不同流速下分别以十二烷基磺酸钠 (Sodium dodecyl sulfate,SDS) 灌注 (S组),Triton X-100联合SDS灌注 (TS组),反复冻融后Triton X-100联合SDS灌注(FTS组),制备肾脏脱细胞支架,并测定其流体分布及脉管阻力。HE染色、DAPI染色、DNA定量检测脱细胞支架脱细胞程度,Masson染色、PAS染色、免疫组织化学染色检测脱细胞支架主要成分的保留和结构的完整,扫描电镜检测支架的超微结构,MTT法检测支架的细胞毒性,ELISA检测支架中生长因子的含量。结果显示,FTS组脱细胞用时较S组、TS组少,10 mL/min组支架脉管阻力较低,S组、TS组、FTS组流体分布与Control组存在差异。HE染色和DAPI染色显示各组支架未见细胞成分残留,DNA含量<50 ng/mg。Masson染色和PAS染色可见细胞外网状胶原及多糖,免疫组织化学染色见Ⅰ型胶原 (CollagenⅠ)、Ⅳ型胶原蛋白 (Collagen Ⅳ)、纤维连接蛋白 (Fibronectin)、层粘连蛋白 (Laminin) 表达。扫描电镜见支架呈蜂窝状结构。MTT法检测支架细胞毒性分级在0–1级之间。ELISA检测提示FTS组VEGF、EGF、IGF-1、PDGF含量明显高于S组和TS组。综上,联合冻融和灌注法能够制备更为理想且有效的大鼠肾脏整器官脱细胞支架,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理学研究奠定基础。
英文摘要:
      We explored the improved method to prepare decellularized kidney scaffold and provide experimental basis for kidney tissue engineering and renal pathology and toxicology in vitro research. We perfused rat kidneys with PBS (group control) and prepared the decellularized kidney scaffolds with sodium dodecyl sulfate (SDS) (group S), Triton X-100 combined with SDS (group TS), and Triton X-100 combined with SDS after repeated freezing and thawing (group FTS) in different flow velocity. Meanwhile we measured their fluid distributions and vascular resistance. We examined the degree of decellularization of acellular scaffolds by HE, DAPI staining and DNA quantification. We examined the retention of main composition and structural integrity of decellularized scaffolds by Masson, PAS and immunohistochemical staining. We also detected the ultrastructure, cytotoxicity and the level of growth factor of the scaffolds by scanning electron microscope, MTT and ELISA, respectively. The results showed that the time of decellularization in group FTS was less than that in group S and TS. The vascular resistance of scaffolds decellularized at 10 mL/min flow velocity was lower. The fluid distribution in groups S, TS and FTS was different from that in control group. No residual cell was detected by HE and DAPI staining. DNA content was less than 50 ng/mg. Masson, PAS and immunohistochemical staining results showed that there was extracellular collagen, polysaccharide, type I collagen, type IV collagen, fibronectin and laminin in the decellularized scaffolds, and the scanning electron microscope result showed the scaffolds had the honeycomb structure. The cytotoxicity level of decellularized scaffolds was between grade 0 to 1. The level of VEGF, EGF, IGF-1 and PDGF-BB in group FTS were significantly higher than those in group S and TS. In concluding, combining freeze-thawing with perfusion can produce more ideal and effective whole organ decellularized scaffold of rat kidney, and make a foundation for the study of kidney tissue engineering and in vitro pathology and toxicology of kidney.
胡东,张德迎,刘博,周宇,余熠杭,沈炼桔,龙春兰,刘星,林涛,何大维,魏光辉.冻融联合灌注法优化大鼠肾脏脱细胞支架的制备[J].生物工程学报,2019,35(2):307~318
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