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2010年第26卷第4期文章目次
2010, 26(4):421-430.
摘要:
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
2010, 26(4):431-438.
摘要:
乙型肝炎病毒核心蛋白 (Hepatitis B virus core protein，HBc) 可以形成二十面体对称的颗粒样结构，由于其N端、C端和主要免疫显性区域 (Major immunodominant region，MIR) 允许一定程度的缺失和外源插入，并且能够将外源序列重复且高密度地暴露在颗粒的表面，诱发强烈的外源序列特异的体液和细胞免疫反应，从上世纪80年代中期就开始被运用于表位疫苗的研究。以下主要从影响HBc作为表位疫苗载体的因素，包括HBc长度、外源插入位点和表位序列的性质等来介绍HBc作为表位疫苗载体的应用。
乙型肝炎病毒核心蛋白 (Hepatitis B virus core protein，HBc) 可以形成二十面体对称的颗粒样结构，由于其N端、C端和主要免疫显性区域 (Major immunodominant region，MIR) 允许一定程度的缺失和外源插入，并且能够将外源序列重复且高密度地暴露在颗粒的表面，诱发强烈的外源序列特异的体液和细胞免疫反应，从上世纪80年代中期就开始被运用于表位疫苗的研究。以下主要从影响HBc作为表位疫苗载体的因素，包括HBc长度、外源插入位点和表位序列的性质等来介绍HBc作为表位疫苗载体的应用。
2010, 26(4):439-447.
摘要:
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
2010, 26(4):448-453.
摘要:
为构建表达人神经元素3基因 (neurogenin 3，ngn3) 的重组逆转录病毒载体，建立稳定表达ngn3的包装细胞株，本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料，通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因，将其连接到 pMD18-T 载体上并测序，结果表明，测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列 (GenBank Accession No. BC126468) 完全一致。将EcoR I和Hpa I双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中，酶切鉴定结果表明，pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将 pMSCV-ngn3 重组载体导入PT67包装细胞，G418筛选后，对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测，结果显示，该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3；收集该细胞株的培养上清液，进行RT-PCR检测及电镜观察，结果表明，该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒，并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立，为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。
为构建表达人神经元素3基因 (neurogenin 3，ngn3) 的重组逆转录病毒载体，建立稳定表达ngn3的包装细胞株，本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料，通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因，将其连接到 pMD18-T 载体上并测序，结果表明，测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列 (GenBank Accession No. BC126468) 完全一致。将EcoR I和Hpa I双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中，酶切鉴定结果表明，pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将 pMSCV-ngn3 重组载体导入PT67包装细胞，G418筛选后，对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测，结果显示，该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3；收集该细胞株的培养上清液，进行RT-PCR检测及电镜观察，结果表明，该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒，并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立，为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。
2010, 26(4):454-461.
摘要:
VP1蛋白是口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV) 诱导机体产生抗病毒感染免疫的主要蛋白，含有病毒的若干中和表位。本研究设计和合成了由Asia I型FMDV VP1蛋白136~160aa和198~211aa两个表位组成的重复串联表位的编码基因，并克隆了羊IgG重链恒定区编码基因。利用BamH I、EcoR I和Xho I位点将2个基因片段依次克隆到pPROExHTb载体，构建成重组质粒pPRO-FshIgG，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以IPTG诱导表达得到融合蛋白FshIgG。100 μg FshIgG蛋白免疫豚鼠后刺激豚鼠产生了高效价的FMDV中和抗体，而且使这些免疫豚鼠在用200 ID50剂量FMDV攻击时得到了完全保护。由此证明，羊IgG重链恒定区蛋白能够作为FMDV表位肽的载体，而融合蛋白FshIgG可成为一种口蹄疫表位疫苗候选物用于口蹄疫的预防。
VP1蛋白是口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV) 诱导机体产生抗病毒感染免疫的主要蛋白，含有病毒的若干中和表位。本研究设计和合成了由Asia I型FMDV VP1蛋白136~160aa和198~211aa两个表位组成的重复串联表位的编码基因，并克隆了羊IgG重链恒定区编码基因。利用BamH I、EcoR I和Xho I位点将2个基因片段依次克隆到pPROExHTb载体，构建成重组质粒pPRO-FshIgG，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以IPTG诱导表达得到融合蛋白FshIgG。100 μg FshIgG蛋白免疫豚鼠后刺激豚鼠产生了高效价的FMDV中和抗体，而且使这些免疫豚鼠在用200 ID50剂量FMDV攻击时得到了完全保护。由此证明，羊IgG重链恒定区蛋白能够作为FMDV表位肽的载体，而融合蛋白FshIgG可成为一种口蹄疫表位疫苗候选物用于口蹄疫的预防。
2010, 26(4):462-469.
摘要:
本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3 (Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3) 的重组腺病毒表达载体，获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因，将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV，经测序验证后，重组的穿梭质粒用Pme I酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组，获得的重组质粒pAd-SOCS3，经Pac I线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增，纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后，荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达，RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确，病毒滴度为1.2×109 PFU/mL；感染原代培养的猪脂肪细胞后，荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达；RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒，感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白，为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。
本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3 (Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3) 的重组腺病毒表达载体，获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因，将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV，经测序验证后，重组的穿梭质粒用Pme I酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组，获得的重组质粒pAd-SOCS3，经Pac I线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增，纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后，荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达，RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确，病毒滴度为1.2×109 PFU/mL；感染原代培养的猪脂肪细胞后，荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达；RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒，感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白，为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。
2010, 26(4):470-475.
摘要:
本研究旨为克隆鸡氨肽酶N(chAPN) 基因，高效表达可溶性目的蛋白，并测定其生物学功能。应用RT-PCR方法从鸡胚肾细胞中克隆chAPN的基因片段，经测序鉴定后再克隆至原核表达载体pCOLD-TF，构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-chAPN，在大肠杆菌BL21(DE3) 中经不同条件诱导表达目的蛋白；利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白，并进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定；Leu-PNA酶促反应和ELISA等方法检测目的蛋白生物学功能。结果显示，重组质粒pCOLD-TF-chAPN在大肠杆菌中以可溶形式高效表达；酶促反应及ELISA结果显示该蛋白具有酶活性，可结合传染性支气管炎病毒(IBV)，并表现为剂量依赖性。这为今后研究chAPN的酶活性、作为IBV受体及抗病毒功能奠定了实验基础。
本研究旨为克隆鸡氨肽酶N(chAPN) 基因，高效表达可溶性目的蛋白，并测定其生物学功能。应用RT-PCR方法从鸡胚肾细胞中克隆chAPN的基因片段，经测序鉴定后再克隆至原核表达载体pCOLD-TF，构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-chAPN，在大肠杆菌BL21(DE3) 中经不同条件诱导表达目的蛋白；利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白，并进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定；Leu-PNA酶促反应和ELISA等方法检测目的蛋白生物学功能。结果显示，重组质粒pCOLD-TF-chAPN在大肠杆菌中以可溶形式高效表达；酶促反应及ELISA结果显示该蛋白具有酶活性，可结合传染性支气管炎病毒(IBV)，并表现为剂量依赖性。这为今后研究chAPN的酶活性、作为IBV受体及抗病毒功能奠定了实验基础。
2010, 26(4):476-482.
摘要:
为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性，将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡，通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型 (IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示，rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示，rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(?-IFN) 和Th2(IL-4) 类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85％的保护率，表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。
为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性，将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡，通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型 (IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示，rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示，rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(?-IFN) 和Th2(IL-4) 类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85％的保护率，表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。
2010, 26(4):483-488.
摘要:
利用T_RFLP (末端限制性片段长度多态性) 技术，分析硝化细菌富集反应器中的微生物群落结构，并对硝化细菌的丰度进行半定量研究。结果表明，培养48 h后，硝化细菌富集效果最佳，多样性指数与初始培养相比下降了62.80％，富集出的硝化细菌主要为亚硝酸盐氧化菌 (Nitrobacter)。同时对投加该硝化细菌前后的对虾养殖水体进行微生物多样性的动态研究，并推测了虾塘水中可能稳定存在的几种主要细菌种类，其中投加富集硝化细菌前后均存在的细菌种类包括短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、微杆菌Microbacterium lactium、固氮弧菌Azoarcus indigens或者霍氏鲍特菌Bordetella holmesii。
利用T_RFLP (末端限制性片段长度多态性) 技术，分析硝化细菌富集反应器中的微生物群落结构，并对硝化细菌的丰度进行半定量研究。结果表明，培养48 h后，硝化细菌富集效果最佳，多样性指数与初始培养相比下降了62.80％，富集出的硝化细菌主要为亚硝酸盐氧化菌 (Nitrobacter)。同时对投加该硝化细菌前后的对虾养殖水体进行微生物多样性的动态研究，并推测了虾塘水中可能稳定存在的几种主要细菌种类，其中投加富集硝化细菌前后均存在的细菌种类包括短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、微杆菌Microbacterium lactium、固氮弧菌Azoarcus indigens或者霍氏鲍特菌Bordetella holmesii。
2010, 26(4):489-494.
摘要:
本实验通过研究缺氮、缺锰和缺硫对蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa产氢的影响，发现缺氮、缺锰及缺硫条件下该藻均能产氢，但在缺氮条件下产氢量最高，约为 88.613 μL H2/mg Chla，分别是对照组、缺锰和缺硫实验组产氢量的 4.61倍、1.92倍和3.63倍。通过对光合、呼吸及生长的比较研究，发现缺锰对该藻光合、呼吸及生长的影响要小于缺氮和缺硫；与正常培养条件相比，缺锰、缺硫抑制藻细胞的光合放氧和生长，对呼吸影响小，而缺氮不仅最大程度抑制光合放氧和生长，同时使呼吸作用增强，这为进一步优化该藻产氢条件及研究其产氢机制提供了线索。
本实验通过研究缺氮、缺锰和缺硫对蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa产氢的影响，发现缺氮、缺锰及缺硫条件下该藻均能产氢，但在缺氮条件下产氢量最高，约为 88.613 μL H2/mg Chla，分别是对照组、缺锰和缺硫实验组产氢量的 4.61倍、1.92倍和3.63倍。通过对光合、呼吸及生长的比较研究，发现缺锰对该藻光合、呼吸及生长的影响要小于缺氮和缺硫；与正常培养条件相比，缺锰、缺硫抑制藻细胞的光合放氧和生长，对呼吸影响小，而缺氮不仅最大程度抑制光合放氧和生长，同时使呼吸作用增强，这为进一步优化该藻产氢条件及研究其产氢机制提供了线索。
2010, 26(4):495-502.
摘要:
为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂，需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了CtpA的基因，连接至表达载体pET-28a中，构建了重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达，通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化，SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物，采用高效液相色谱法测定了其水解活性，结果表明活性可达1.10 nmol/(mg?min)，为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定其血清抗体的效价高达1：100 000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。
为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂，需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了CtpA的基因，连接至表达载体pET-28a中，构建了重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达，通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化，SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物，采用高效液相色谱法测定了其水解活性，结果表明活性可达1.10 nmol/(mg?min)，为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定其血清抗体的效价高达1：100 000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。
2010, 26(4):503-508.
摘要:
本实验旨在研究透性化嗜酸乳杆菌细胞生物转化共轭亚油酸的反应动力学。探讨了细胞浓度、底物浓度、反应体系pH值和温度等因素对生物转化共轭亚油酸反应速度的影响；建立了透性化嗜酸乳杆菌细胞生物转化共轭亚油酸的动力学模型。结果表明，透性化嗜酸乳杆菌细胞有利于共轭亚油酸的生物转化，最适细胞浓度、pH值和反应温度分别为10×1010 ufc/mL、4.5和45℃；生物转化共轭亚油酸存在底物抑制现象，当亚油酸的浓度为0.6 mg/mL时，反应速度达到最大值17.8 μg/(mL?min)。在低亚油酸浓度下，反应初始阶段的反应规律与经典米氏方程相符，而在高亚油酸浓度下，存在底物抑制现象。在最适反应条件下建立了动力学模型，模型基本反映了共轭亚油酸的生物转化特性。
本实验旨在研究透性化嗜酸乳杆菌细胞生物转化共轭亚油酸的反应动力学。探讨了细胞浓度、底物浓度、反应体系pH值和温度等因素对生物转化共轭亚油酸反应速度的影响；建立了透性化嗜酸乳杆菌细胞生物转化共轭亚油酸的动力学模型。结果表明，透性化嗜酸乳杆菌细胞有利于共轭亚油酸的生物转化，最适细胞浓度、pH值和反应温度分别为10×1010 ufc/mL、4.5和45℃；生物转化共轭亚油酸存在底物抑制现象，当亚油酸的浓度为0.6 mg/mL时，反应速度达到最大值17.8 μg/(mL?min)。在低亚油酸浓度下，反应初始阶段的反应规律与经典米氏方程相符，而在高亚油酸浓度下，存在底物抑制现象。在最适反应条件下建立了动力学模型，模型基本反映了共轭亚油酸的生物转化特性。
2010, 26(4):509-516.
摘要:
26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物，它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18 d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因 (GenBank Accession No. AY813725)，序列分析表明该基因的开放阅读框 (ORF) 含708 bp，编码235个氨基酸，理论分子量25.84 kDa。同源性分析结果显示，该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基，命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d虫体中都有表达，7 d和23 d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2，在大肠杆菌系统中成功获得了表达，重组蛋白以包涵体形式存在，Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别，并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33％的减虫率和35.23％的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得，为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。
26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物，它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18 d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因 (GenBank Accession No. AY813725)，序列分析表明该基因的开放阅读框 (ORF) 含708 bp，编码235个氨基酸，理论分子量25.84 kDa。同源性分析结果显示，该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基，命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d虫体中都有表达，7 d和23 d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2，在大肠杆菌系统中成功获得了表达，重组蛋白以包涵体形式存在，Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别，并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33％的减虫率和35.23％的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得，为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。
2010, 26(4):517-522.
摘要:
克隆表达噬菌体D29 LysinB (LysB) 并对其酶学性质进行研究。以噬菌体D29基因组为模板，用PCR方法扩增lys B基因，与表达载体pET22b连接，将重组质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3) 中表达，镍柱亲和层析 (Ni-NTA) 纯化可溶性表达产物，并对重组蛋白的活性进行分析检测。结果表明：成功构建了pET22b-lysB表达载体，并从1 L的LB培养物中获得了33.2 mg高纯度重组蛋白 (His-LysB)；His-LysB具有分解脂肪的能力，属于脂肪酶；生物化学特性分析表明：丁酸对硝基苯 (pNPB) 为水解底物，His-LysB热稳定性不佳，30℃以下比较稳定，随着温度的升高，稳定性逐渐降低；该蛋白具有较高的pH值适应性，pH 5.0~9.5范围内稳定性较高；在23℃和pH 7.5时酶活力最高，其比酶活为1.3 U/mg；金属离子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟 (PMSF) 抑制剂对酶活具有强烈的抑制作用。本研究为开发新的治疗结核药物提供了一个新的选择。
克隆表达噬菌体D29 LysinB (LysB) 并对其酶学性质进行研究。以噬菌体D29基因组为模板，用PCR方法扩增lys B基因，与表达载体pET22b连接，将重组质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3) 中表达，镍柱亲和层析 (Ni-NTA) 纯化可溶性表达产物，并对重组蛋白的活性进行分析检测。结果表明：成功构建了pET22b-lysB表达载体，并从1 L的LB培养物中获得了33.2 mg高纯度重组蛋白 (His-LysB)；His-LysB具有分解脂肪的能力，属于脂肪酶；生物化学特性分析表明：丁酸对硝基苯 (pNPB) 为水解底物，His-LysB热稳定性不佳，30℃以下比较稳定，随着温度的升高，稳定性逐渐降低；该蛋白具有较高的pH值适应性，pH 5.0~9.5范围内稳定性较高；在23℃和pH 7.5时酶活力最高，其比酶活为1.3 U/mg；金属离子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟 (PMSF) 抑制剂对酶活具有强烈的抑制作用。本研究为开发新的治疗结核药物提供了一个新的选择。
2010, 26(4):523-529.
摘要:
为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株，并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性，应用RT-PCR方法从泌乳3 d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077 bp的PLF-N基因片段，与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比，核苷酸同源性均达到99％以上。为了得到高表达量的PLF-N基因，以扩增的PLF-N片段为参考模板，经过密码子优化，全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中，转化大肠杆菌BL21，获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21；经IPTG诱导，并对表达条件进行优化，以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达，其产物分子量约为42 kDa，最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32％，表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98％。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达，是一种提高表达效率的有效手段。
为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株，并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性，应用RT-PCR方法从泌乳3 d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077 bp的PLF-N基因片段，与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比，核苷酸同源性均达到99％以上。为了得到高表达量的PLF-N基因，以扩增的PLF-N片段为参考模板，经过密码子优化，全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中，转化大肠杆菌BL21，获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21；经IPTG诱导，并对表达条件进行优化，以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达，其产物分子量约为42 kDa，最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32％，表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98％。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达，是一种提高表达效率的有效手段。
2010, 26(4):530-537.
摘要:
本研究通过对霞多丽葡萄花前约10 d的花丝进行组培诱导，获得胚性和非胚性两种愈伤组织，分别进行继代、组织结构观察和体细胞胚的诱导验证。为研究两种愈伤组织对培养基中主要碳源蔗糖的利用特点，根据GenBank中的定位于细胞质膜的葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC12和VvSUC27的序列，设计了这两种蔗糖转运蛋白的PCR引物。以RNAplant试剂法，提取胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的RNA，进行半定量RT-PCR。研究表明，31个循环半定量RT-PCR结果中VvSUC12在胚性愈伤和非胚性愈伤中均有表达，且在非胚性愈伤组织中的表达水平稍高于胚性愈伤组织，表达差异未达到显著水平，VvSUC27的表达水平明显低于VvSUC12，且只在胚性愈伤组织中表达。提高至35个循环的半定量RT-PCR结果显示VvSUC27基因在非胚性愈伤组织中微弱表达，而在胚性愈伤组织中的表达强度较31个循环有所增加，且高于非胚性愈伤。
本研究通过对霞多丽葡萄花前约10 d的花丝进行组培诱导，获得胚性和非胚性两种愈伤组织，分别进行继代、组织结构观察和体细胞胚的诱导验证。为研究两种愈伤组织对培养基中主要碳源蔗糖的利用特点，根据GenBank中的定位于细胞质膜的葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC12和VvSUC27的序列，设计了这两种蔗糖转运蛋白的PCR引物。以RNAplant试剂法，提取胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的RNA，进行半定量RT-PCR。研究表明，31个循环半定量RT-PCR结果中VvSUC12在胚性愈伤和非胚性愈伤中均有表达，且在非胚性愈伤组织中的表达水平稍高于胚性愈伤组织，表达差异未达到显著水平，VvSUC27的表达水平明显低于VvSUC12，且只在胚性愈伤组织中表达。提高至35个循环的半定量RT-PCR结果显示VvSUC27基因在非胚性愈伤组织中微弱表达，而在胚性愈伤组织中的表达强度较31个循环有所增加，且高于非胚性愈伤。
2010, 26(4):538-544.
摘要:
蓝藻抗病毒蛋白-N (Cyanovirin-N，CVN) 具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性，该蛋白序列特殊，难以重组制备，在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化，通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列，构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化，发现以0.5 mmol/L IPTG在20℃诱导24 h可获得最高表达，SDS-PAGE结果显示，SUMO-CVN为可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的28％；经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明，重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明，重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性；这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。
蓝藻抗病毒蛋白-N (Cyanovirin-N，CVN) 具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性，该蛋白序列特殊，难以重组制备，在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化，通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列，构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化，发现以0.5 mmol/L IPTG在20℃诱导24 h可获得最高表达，SDS-PAGE结果显示，SUMO-CVN为可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的28％；经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明，重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明，重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性；这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。
2010, 26(4):545-549.
摘要:
为了优化将抗体偶联在二氧化硅试管表面上以便进行丙型肝炎抗原检测的分析系统，本研究通过氨基硅烷的活化作用，在玻璃表面形成活化的氨基，以戊二醛作为化学交联试剂，在已硅化的玻璃表面固定丙肝单克隆抗体，并进行丙肝抗原 (HCAg) 的测定。结果显示，通过条件优化实验，发现以10％ (V/V) 的氨基硅烷水溶液处理玻璃试管3 h后，再用3％ (V/V) 的戊二醛水溶液交联丙肝单克隆抗体2 h，可以得到固定效果较好，非特异性较低的玻璃载体，对HCAg可测至1 μg/L。可见，用该方法制备的玻璃载体可为进一步建立新的HCAg磁性免疫检测系统提供理论和实验依据。
为了优化将抗体偶联在二氧化硅试管表面上以便进行丙型肝炎抗原检测的分析系统，本研究通过氨基硅烷的活化作用，在玻璃表面形成活化的氨基，以戊二醛作为化学交联试剂，在已硅化的玻璃表面固定丙肝单克隆抗体，并进行丙肝抗原 (HCAg) 的测定。结果显示，通过条件优化实验，发现以10％ (V/V) 的氨基硅烷水溶液处理玻璃试管3 h后，再用3％ (V/V) 的戊二醛水溶液交联丙肝单克隆抗体2 h，可以得到固定效果较好，非特异性较低的玻璃载体，对HCAg可测至1 μg/L。可见，用该方法制备的玻璃载体可为进一步建立新的HCAg磁性免疫检测系统提供理论和实验依据。
2010, 26(4):550-556.
摘要:
贻贝抗菌肽Mytilin是贻贝免疫系统的重要组成部分，对其结构与功能的研究表明，其序列中连接两段β-折叠的发夹区域是其抗菌功能的关键所在。为验证该区域是否具有抗菌活性，通过对厚壳贻贝Mytilus coruscus抗菌肽Mytilin进行空间结构模拟，选取其中β-发夹部分肽段，采用了固相化学合成的方法合成了两条10肽，分别命名为Mytilin Derived Peptide-1 (MDP-1) 和 Mytilin Derived Peptide-2 (MDP-2) 。高效液相色谱以及质谱检测结果表明，合成是成功的。抗菌谱研究表明，MDP-1和MDP-2 对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均具有明显的抑制作用，同时，合成的MDP由于序列短且有两对二硫键，因此对于温度及人血浆均表现出很强的稳定性。上述研究结果为深入了解厚壳贻贝抗菌肽Mytilin的抗菌机制以及在此基础上开发具有应用价值的新型抗菌肽奠定了基础。
贻贝抗菌肽Mytilin是贻贝免疫系统的重要组成部分，对其结构与功能的研究表明，其序列中连接两段β-折叠的发夹区域是其抗菌功能的关键所在。为验证该区域是否具有抗菌活性，通过对厚壳贻贝Mytilus coruscus抗菌肽Mytilin进行空间结构模拟，选取其中β-发夹部分肽段，采用了固相化学合成的方法合成了两条10肽，分别命名为Mytilin Derived Peptide-1 (MDP-1) 和 Mytilin Derived Peptide-2 (MDP-2) 。高效液相色谱以及质谱检测结果表明，合成是成功的。抗菌谱研究表明，MDP-1和MDP-2 对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均具有明显的抑制作用，同时，合成的MDP由于序列短且有两对二硫键，因此对于温度及人血浆均表现出很强的稳定性。上述研究结果为深入了解厚壳贻贝抗菌肽Mytilin的抗菌机制以及在此基础上开发具有应用价值的新型抗菌肽奠定了基础。
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