2021年第10期文章目次

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  • 1  封面
    2021, 61(10):0-0.
    [摘要](68) [HTML](19) [PDF 23.45 M](233)
    摘要:
    2  目录
    2021, 61(10):0-0.
    [摘要](49) [HTML](19) [PDF 611.16 K](58)
    摘要:
    3  CRISPR/Cas基因组编辑技术在乳酸菌中的应用及研究展望
    李伟勋,芦晶,张书文,逄晓阳,吕加平
    2021, 61(10):2971-2985. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200730
    [摘要](326) [HTML](120) [PDF 498.29 K](217)
    摘要:
    乳酸菌是一类重要的食品工业微生物,目前对其功能基因鉴定和挖掘优良功能基因主要依赖于传统的基因同源重组技术,该技术尽管有较高的可靠性,但是存在操作繁琐、效率低下等不足,严重制约了乳酸菌优良菌株的遗传选育。CRISPR/Cas基因编辑技术极大提升了对多物种基因组的编辑效率,这为乳酸菌功能基因的快速鉴定及遗传改良提供了可能,但是现有的CRISPR/Cas基因编辑技术在乳酸菌的应用还存在诸多限制。本文综述了CRISPR/Cas基因编辑技术在乳酸菌基因组上的应用现状及亟待解决的问题,并展望了乳酸菌基因组编辑技术的未来发展趋势,为乳酸菌功能基因鉴定及遗传改良提供参考。
    4  真菌组蛋白赖氨酸甲基转移酶的研究进展
    李梦雪,李亚楠,曲音波,秦玉琪
    2021, 61(10):2986-2998. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200734
    [摘要](141) [HTML](62) [PDF 457.10 K](91)
    摘要:
    甲基化修饰是蛋白翻译后修饰的主要方式之一。真菌中,多种赖氨酸甲基转移酶能够执行组蛋白特定位点上赖氨酸的甲基化。组蛋白上赖氨酸的甲基化与真菌DNA的复制、转录以及异染色质的形成相关。甲基化参与了多种生物学过程,如真菌发育、昼夜节律调节、次级代谢基因簇表达、水解酶合成、致病真菌毒力形成。本文结合笔者工作,对目前真菌中已经发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶的命名、分类、结构域特征、催化域的三维结构以及它们所执行的甲基化在各种真菌中的作用进行了总结,提出了目前研究的不足并对未来的研究方向和内容进行了展望。
    5  基于环介导等温扩增技术的微流控芯片在病原菌检测方面的研究进展
    尚玉婷,叶青华,蔡淑珍,吴清平,张菊梅
    2021, 61(10):2999-3009. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200780
    [摘要](116) [HTML](76) [PDF 488.17 K](94)
    摘要:
    环介导等温扩增(LAMP)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,与微流控芯片技术相结合,可实现对病原菌的快速检测,具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点。本文根据不同终产物的检测方法对目前检测病原菌的相关微流控LAMP芯片进行了分类与介绍,并对技术的改进和存在的问题进行了分析,以期为后续的相关研究提供参考。
    6  免疫抑制剂霉酚酸的研究及产业化进展
    黄润业,亓兰达,陈国参,尹文兵
    2021, 61(10):3010-3025. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200786
    [摘要](85) [HTML](58) [PDF 607.80 K](80)
    摘要:
    霉酚酸是世界上应用最广泛的免疫抑制剂之一,市场需求巨大。目前为止,主要是通过真菌发酵的方式进行霉酚酸的工业生产,而用于生产的菌株多是经过诱变的高产短密青霉菌。本文从霉酚酸的研究应用现状、化学合成以及生物合成途径、遗传调控、发酵生产以及市场分析等方面对霉酚酸的研究及产业化进展进行了系统综述。为该药物的新颖衍生物开发、提高产率以及应用先进生物技术智能化创制提供重要参考和依据。
    7  联合固氮菌的合成生物学研究进展
    荆晓姝,丁燕,韩晓梅,王哲,高德艳
    2021, 61(10):3026-3034. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200796
    [摘要](124) [HTML](57) [PDF 341.36 K](93)
    摘要:
    氮素是作物生长过程中最重要的元素,氮素缺乏将会严重影响作物生长。随着人类对粮食的需求量增加,化学氮肥的施用量越来越多。生物固氮在全球氮素循环中有着重要的作用,60%的氮来源于生物固氮。因此,生物固氮,尤其是能够在作物中定殖的联合固氮菌,最有可能代替氮肥成为粮食作物的主要氮源。长期以来,如何提高生物固氮效率以及在作物中实现生物固氮是生物学家的重要研究方向。合成生物学的出现和发展为能够生物固氮的研究带了新的机遇,有望缓解粮食作物对化学氮肥的大量需求。本文概述了固氮菌的种类、联合固氮菌中固氮基因岛的组成以及转录调控机理,阐述了合成生物学在生物固氮领域中的研究现状,对未来的联合固氮菌合成生物学的发展方向作出了展望。
    8  枯草芽孢杆菌疏水蛋白BslA的结构及应用
    宋晶磊,肖云杰,杨海涛,王泽方
    2021, 61(10):3035-3045. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210011
    [摘要](114) [HTML](53) [PDF 403.22 K](92)
    摘要:
    疏水蛋白(Hydrophobin)是具有表面活性的小分子量蛋白质,可以在界面自组装形成双亲性蛋白膜,从而改变界面亲疏水性。研究表明疏水蛋白无毒性且无免疫原性,基于这样的性质,疏水蛋白可用于材料表面修饰、食品塑形剂、纳米药物载体而进行靶向运输或生物传感器的信号精确识别等。近年来,在枯草芽孢杆菌生物被膜中发现了一种分泌型小分子量疏水蛋白BslA (原名YuaB)。研究表明,枯草芽孢杆菌疏水蛋白BslA表达产量高,纯化过程简单、易于操作,可实现大规模生产,因而BslA具有更大的应用优势和开发价值。本文总结了BslA的性质、功能、结构等方面的信息,并与真菌疏水蛋白进行了比较分析,系统分析了其结构特点及应用价值。
    9  鱼类肠道微生物与宿主免疫系统相互作用研究进展
    张碧云,杨红玲,汪攀,孙云章
    2021, 61(10):3046-3058. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210027
    [摘要](107) [HTML](78) [PDF 352.29 K](77)
    摘要:
    鱼类肠道中存在大量微生物,对于维持宿主健康具有重要作用。鱼类免疫系统能够监视并调控肠道微生物组成,维持肠道菌群稳态。同时,鱼类肠道共生微生物调节鱼类免疫系统,抑制病原微生物的过度增殖,保证宿主的健康。本文回顾了鱼类肠道微生物与宿主免疫系统相互作用的研究进展,重点介绍了宿主免疫系统识别肠道微生物、塑造肠道菌群以及益生菌对宿主免疫和肠道菌群的调控等,提出了理想的益生菌应该来自动物自身胃肠道,生产中应谨慎选用非宿主来源的益生菌,以期为推动鱼类肠道功能微生物开发和应用提供理论支撑。
    10  基因工程微生物合成鼠李糖脂表面活性剂的研究进展
    张嵩元,汪卫东
    2021, 61(10):3059-3075. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200726
    [摘要](52) [HTML](119) [PDF 815.98 K](52)
    摘要:
    鼠李糖脂是一类重要的生物表面活性剂。相比于化学合成的表面活性剂,其具有更优秀的理化性质及环境友好等特点,被广泛应用于微生物采油、环境污染修复等工程中。目前,鼠李糖脂的工业生产主要采用铜绿假单胞菌这一具有致病性的天然合成菌株,与此同时,受菌株遗传背景的限制,优化发酵过程等方法在产量提升方面遇到了一些瓶颈问题。利用基因工程方法对菌株进行改良有望进一步提高鼠李糖脂生产的安全性、产量、产物性能等多项指标,因此受到了越来越广泛的关注。本文综述了近年来利用基因工程方法优化鼠李糖脂生物合成的最新进展,讨论了异源合成、代谢通路改造、基因表达优化、蛋白质工程、底盘工程等多种策略的应用,并展望了一系列可行的研究方向。
    11  基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定
    王俊博,孔令新,乔永健,张大杉,邓子新,由德林
    2021, 61(10):3076-3086. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200724
    [摘要](77) [HTML](60) [PDF 552.30 K](66)
    摘要:
    [目的] 分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。[方法] 利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosus var.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。[结果] 本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。[结论] 本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。
    12  基于高通量测序技术分析四川两个奶牛场乳汁的菌群差异
    吕倩,马莉,骆巧,罗雪,陈久兵,罗正中,雍康,姚学萍,余树民,沈留红,曹随忠
    2021, 61(10):3087-3102. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200728
    [摘要](101) [HTML](62) [PDF 982.03 K](86)
    摘要:
    [目的] 本试验测定了两个奶牛场健康乳汁和乳房炎乳汁中微生物菌群的变化,以揭示不同奶牛场之乳汁菌群的异同,评估其对乳汁代谢的影响是否相同。[方法] 采用16S rRNA高通量测序技术,分别测定两个奶牛场6头健康奶牛和6头乳房炎奶牛乳汁中微生物16S rRNA V4区序列,并对菌群群落结构和多样性进行比较,分析场内及场间的乳汁菌群差异。[结果] 四组乳汁样本共获得4013234条原始序列,经过滤后获得2887024条优化序列。Alpha多样性Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数差异均不显著(P>0.05);Beta多样性四组样本均分别聚类;在场1和场2中,引起奶牛乳房炎的优势菌属分别是克雷伯氏菌属和埃希氏菌属;在2个奶牛场的健康乳汁中,场2的埃希氏菌属、葡萄球菌属的丰度显著高于场1;在2个奶牛场的乳房炎乳汁中,场2的埃希氏菌属、乳球菌属的丰度显著高于场1;2个奶牛场健康乳汁中的嗜冷菌总丰度分别为31.87%和38.72%;关联分析及功能预测分析表明,2个奶牛场健康乳汁与乳房炎乳汁优势物种之间的关系差异较大;场1无论是Level 1还是Level 2水平,均发现显著性差异的代谢通路,而场2均未发现显著性差异的代谢通路。[结论] 本试验研究了两个奶牛场健康乳汁和乳房炎乳汁微生物菌群之间的异同,为两个奶牛场在乳房炎的预防工作以及原料奶在冷链运输过程中质量控制提供理论依据。
    13  鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选
    聂细荣,薛明洋,林格,李逸群,范玉顶,刘文枝,孟彦,江南,曾令兵,周勇
    2021, 61(10):3103-3113. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200740
    [摘要](56) [HTML](44) [PDF 506.02 K](48)
    摘要:
    [目的] 鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。[方法] 本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2H Gold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。[结果] ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。[结论] 本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。
    14  嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4T木聚糖酶的表达纯化及性质研究
    袁鸣一,董佳莹,陈爱玲,鞠斯成,李凡
    2021, 61(10):3114-3127. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200748
    [摘要](86) [HTML](54) [PDF 644.41 K](65)
    摘要:
    [目的] 对嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4T产碱性木聚糖酶进行研究,克隆来源于该菌株的木聚糖酶基因,并对其进行异源表达、纯化及酶学性质的表征,为后续研究碱性木聚糖酶的耐碱机制及应用奠定基础。[方法] 采用单因素分析法对菌株产碱性木聚糖酶情况进行研究;通过基因组分析,锚定5个内切木聚糖酶基因,利用同源扩增的方法进行克隆,并在大肠杆菌中重组表达,利用亲和层析对重组酶进行纯化,以木聚糖为底物表征木聚糖酶的酶学性质。[结果] 来源于C.bogoriensis 69B4T的5种木聚糖酶Xyn370、Xyn393、Xyn425、Xyn466和Xyn486均在大肠杆菌内实现了异源表达,并经亲和层析获得纯酶组分,其最适反应温度分别为60、50、40、40、60℃,在50℃范围内保温2 h,残余酶活均在90%以上;最适反应pH分别为7.0、8.0、8.0、8.0、9.0,在pH 5.0-9.0时具有较好的稳定性;5种重组木聚糖酶对部分金属离子和高浓度盐表现出较好的耐受性,对榉木木聚糖的酶活性最高,均为内切型木聚糖酶。[结论] 本研究表达纯化的5种重组木聚糖酶具有耐盐碱的优良特性,且对温度、某些金属离子和化学试剂耐受,为研究木聚糖酶的耐碱机制及工业应用提供了酶源。
    15  云杉腐烂病菌Cytospora piceae全基因组测序及比较基因组分析
    周文秀,田呈明,游崇娟
    2021, 61(10):3128-3148. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200754
    [摘要](73) [HTML](62) [PDF 970.65 K](88)
    摘要:
    [目的] 壳囊孢属(Cytospora)真菌引起的林木腐烂病和枝枯病,是一类重要的、分布广泛的枝干病害,可引起重大经济损失和生态破坏。通过全基因组测序和比较基因组学分析,探究不同腐烂病菌的全基因组特征,分析其与寄主选择和致病性相关的基因或基因家族的差异性,将有助于进一步揭示腐烂病菌与寄主互作的分子机制,为腐烂病的有效防治提供基础资料。[方法] 采用PacBio测序技术对云杉腐烂病菌Cytospora piceae进行了全基因组测序和组装,并通过比较基因组学方法,从基因组水平探究引起腐烂病的4种腐烂病菌的基因组的差异,分析其共有的和特有的与致病相关的基因家族。[结果] C.piceae基因组大小为39.25 Mb,GC含量为51.79%。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树显示,C.piceaeCytospora chrysosperma的进化关系相近,Valsa maliValsa pyri则更相近。比较基因组学分析表明,4种腐烂病菌均具有重复诱导的点突变(RIP)活性,其中,C.piceae的RIP活性最强。与其他3种腐烂病菌相似,与木质素降解相关的AA3和AA7家族在C.piceae中显著扩张,但木质素降解关键酶AA5家族均缺失;C.piceaeC.chrysosperma基因组中果胶降解关键酶GH28和CE8家族基因的数量与V.maliV.pyri相近。4种腐烂病菌都含有较多数量的MFS (major facilitator superfamily)超家族转运蛋白和较少的ABC (ATP-binding cassette transporter)超家族转运蛋白,但C.piceae含有更多DHA2、PDR和MDR类转运蛋白。4种腐烂病菌的分泌蛋白的GO分类分子功能主要集中在水解酶活性,其中V.mali含有最多数量的该类别基因;而生物学过程则集中在碳水化合物代谢过程、果胶分解过程和氧化还原过程。在次生代谢核心基因中,C.piceae的PKS基因明显少于V.maliV.pyri;在C.piceae含有的4个特异性次生代谢基因中,3个为NRPS基因。[结论] 4种腐烂病菌含有的碳水化合物活性酶的种类和数量相似,且都具有较强的果胶降解能力。不同腐烂病菌的膜转运蛋白中多药转运体的选择性扩增,以及次生代谢核心基因中NRPS类基因的特异性存在和缺失,表明它们作为重要的致病因子很可能在腐烂病菌寄主选择中发挥了重要的作用。
    16  一株MAs (III)脱甲基菌株的分离及功能基因的研究
    李小龙,吴亦飞,张隽
    2021, 61(10):3149-3158. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200756
    [摘要](52) [HTML](57) [PDF 655.56 K](55)
    摘要:
    [目的] 分离并鉴定三价单甲基砷(MAs (III))脱甲基菌株,对MAs (III)脱甲基菌FJ-6中arsI基因进行克隆表达,并对arsI基因表达蛋白进行功能鉴定。[方法] 利用富集培养的方法分离MAs (III)脱甲基菌株,并通过形态学、生理生化特征和16S rDNA基因进化分析进行鉴定;HPLC-ICP-MS鉴定菌株转化MAs (III)的产物为三价砷(As (III)),对菌株FJ-6的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的MAs (III)脱甲基酶编码基因,通过PCR扩增获得arsI全长基因,构建重组质粒pET29a-arsI,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化异源表达的蛋白,以MAs (III)为反应底物,检测MAs (III)脱甲基酶ArsI的酶学特性。通过实时定量PCR观察arsI的表达类型。[结果] Bacillus aryabhattai FJ-6在12 h内能将1 μmol/L MAs (III)完全转化为As (III)。克隆得到MAs (III)脱甲基酶表达基因arsI,构建了pET29a-arsI重组质粒并进行了表达,ArsI蛋白分子量为17.4 kDa。ArsI纯化蛋白具有较高的MAs (III)脱甲基酶的活性;荧光定量PCR实验结果表明arsI受砷诱导表达。[结论] 明确了ArsI蛋白具有MAs (III)脱甲基酶活性。
    17  光唇鱼源无乳链球菌的分离鉴定及遗传特征
    蔺凌云,潘晓艺,姚嘉赟,尹文林,曹铮,刘忆瀚,沈锦玉
    2021, 61(10):3159-3172. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200758
    [摘要](45) [HTML](48) [PDF 726.98 K](50)
    摘要:
    [目的] 为查明浙江养殖光唇鱼大量死亡的病原,了解病原的遗传特征。[方法] 本工作对患病光唇鱼进行病原分离,结合形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性,对分离菌株进行鉴定;采用人工回感试验确定其病原性,并对分离株的血清型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、毒力基因型和表面蛋白抗原基因型等遗传特征进行分析;此外,还测试了菌株的药敏特性。[结果] 从患病光唇鱼体中分离得到优势菌株ACRO-0708,为革兰氏阳性球菌,不溶血,分子与生化鉴定为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);人工感染试验证实其对光唇鱼有较强的致病性,LD50为6.47×103 CFU/g,属于血清型Ⅰb和MLST型ST261,毒力基因型为sip+bibA+cfb+hylB+iagA+fbsA+fbsB+bac-bca-cylE-scpB-lmb-,不携带所检测的6种表面蛋白基因。药敏试验结果显示,对青霉素、氨苄西林等8种药物较敏感,对氯霉素、复方新诺明等7种药物耐药。[结论] 引起浙江养殖光唇鱼死亡的病原菌为无乳链球菌,其分子特征与水产动物主要流行的无乳链球菌株具有显著差异,生产中可选用氨苄西林、氟苯尼考等药物进行防治。
    18  天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成
    赵宇春,刘向阳,邓子新,贺新义,蒋明
    2021, 61(10):3173-3184. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200762
    [摘要](39) [HTML](37) [PDF 656.80 K](37)
    摘要:
    [目的] 在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。[方法] 构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOF MS)鉴定发酵产物分子量。[结果] whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOF MS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C23H16O8;ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C24H18O10。[结论] 本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。
    19  应用GSEA和WGCNA方法分析细菌性败血症宿主关键差异基因及意义
    龚泽龙,高雪锋,李煜彬,黄媛媛,伦静娴,周承星,陈振辉,林琼希,曹虹
    2021, 61(10):3185-3198. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200764
    [摘要](40) [HTML](38) [PDF 1.71 M](44)
    摘要:
    [目的] 采用生物信息学方法分析公共数据库来源的细菌性败血症患者全血转录组学表达谱,探讨细菌败血症相关的宿主关键差异基因及意义。[方法] 基于GEO数据库中GSE80496和GSE72829全血转录组基因数据集,采用GEO2R、基因集富集分析(GSEA)联用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选细菌性败血症患者相比健康人群显著改变的差异基因,通过R软件对交集基因进行GO功能分析和KEGG富集分析。同时,通过String 11.0和Cytoscape分析枢纽基因,验证枢纽基因在数据集GSE72809(Health组52例,Defined sepsis组52例)全血标本中的表达情况,并探讨婴儿性别、月(胎)龄、出生体重、是否接触抗生素等因素与靶基因表达谱间的关系。[结果] 分析GSE80496和GSE72829数据集分别筛选得到932个基因和319个基因,联合WGCNA枢纽模块交集得到与细菌性败血症发病相关的10个枢纽基因(MMP9、ITGAM、CSTD、GAPDH、PGLYRP1、FOLR3、OSCAR、TLR5、IL1RN和TIMP1);GSEA分析获得关键通路(氨基酸糖类-核糖代谢、PPAR信号通路、聚糖生物合成通路、自噬调控通路、补体、凝血因子级联反应、尼古丁和烟酰胺代谢、不饱和脂肪酸生物合成和阿尔兹海默症通路)及生物学过程(类固醇激素分泌、腺苷酸环化酶的激活、细胞外基质降解和金属离子运输)。[结论] 本项研究通过GEO2R、GSEA联用WGCNA分析,筛选出与细菌性败血症发病相关的2个枢纽模块、10个枢纽基因以及一些关键信号通路和生物学过程,可为后续深入研究细菌性败血症致病机制奠定理论依据。
    20  基于环境微生物资源库快速构建易腐垃圾高效堆肥复合菌剂
    张丹,岳华,杨惠兰,兰书焕,李旭东,王臣,谢翼飞
    2021, 61(10):3199-3210. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200766
    [摘要](66) [HTML](39) [PDF 634.65 K](70)
    摘要:
    [目的] 针对易腐垃圾成分快速构建一种高效堆肥复合菌剂。[方法] 研究以"中国科学院战略生物资源服务网络计划"支持建设的微生物资源库为基础,根据菌株产酶活功能信息,针对易腐垃圾有机成分定向挑选出高产酶(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木质素酶、脂肪酶)菌株,通过测定菌株间拮抗作用,构建了一种高效堆肥复合菌剂CM菌剂。进行了菌剂发酵条件优化和易腐垃圾堆肥应用研究。[结果] CM菌剂最适发酵条件为接种7%的种子液于红糖培养基中,30℃下培养48 h,此时菌剂产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木质素酶、脂肪酶酶活分别为181.76、52.92、1.57、12.81、9.94 U/mL。堆肥结果表明CM菌剂堆肥产品pH、含水率、有机质含量均满足生物有机肥标准(NY 884-2012)。CM菌剂堆肥过程中最高温度为63.5℃,高温期9-12 d,30 d后含水率为28.7%,有机质降解率为30.4%,C/N为8.93,与商品菌剂BM相比堆肥效果更好,可使堆体高温期延长4-7 d、含水率降低3.8%,可加快易腐垃圾中有机质降解,降解率提升6.2%,并具有更强的固氮能力,缩短腐熟时间,提升堆肥产品品质。[结论] 基于环境微生物资源库功能信息构建堆肥复合菌剂是一种快速有效的菌剂构建方法。
    21  实时荧光定量PCR检测金山醋酸乳杆菌的方法与应用
    孙佳,陆震鸣,张晓娟,柴丽娟,史劲松,许正宏
    2021, 61(10):3211-3221. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200790
    [摘要](47) [HTML](33) [PDF 528.34 K](48)
    摘要:
    [目的] 建立基于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的金山醋酸乳杆菌特异性检测方法,并将其应用于食醋和白酒发酵过程样品的快速检测。[方法] 筛选金山醋酸乳杆菌基因组中特异性强的基因序列作为模板设计特异性引物,通过标准菌株、醋醅样品进行PCR验证引物的特异性和准确性,建立RT-qPCR方法分析金山醋酸乳杆菌在不同地区酒醅、醋醅和食醋样品中的含量。[结果] 以金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(编码pheS基因)为参考序列,设计了一对GC含量55%、Tm值59℃、可扩增199 bp片段的引物。建立的RT-qPCR方法特异性强、灵敏度高且重复性好,检测浓度范围为2.24-10.24 lg (copies/μL),成功应用于4个地区的酒醅、醋醅和食醋样品检测。对镇江香醋醋酸发酵过程的研究表明,醋醅中的金山醋酸乳杆菌数量先迅速增加,随后稳定在108 copies/g干醅。[结论] 本研究建立的RT-qPCR方法可对食醋和白酒发酵过程中金山醋酸乳杆菌进行特异性鉴定和快速定量。
    22  优化Bacillus subtilis对异源β-1,4-内切木聚糖酶分泌表达的研究
    徐善恒,辛瑜,刘建民,石贵阳,丁重阳,顾正华,李由然,张梁
    2021, 61(10):3222-3234. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200801
    [摘要](38) [HTML](36) [PDF 517.14 K](41)
    摘要:
    [目的] 基于信号肽和信号肽酶在分泌系统中的重要作用,探索短小芽孢杆菌来源中性β-1,4-内切木聚糖酶在Bacillus subtilis中的重组分泌表达与优化。[方法] 首先,从短小芽孢杆菌基因组DNA中扩增β-1,4-内切木聚糖酶全长基因,连接到pWB980载体P43启动子下游,转化B.subtilis WB800构建重组菌NZ-X。之后,构建信号肽筛选载体,对23个从B.subtilis 168基因组DNA中扩增得到的信号肽进行筛选。最后,以B.subtilis WB800的xynA基因为整合位点,分别整合过表达SipS和SipT两个主要信号肽酶,考察其对融合不同信号肽异源蛋白分泌的影响。[结果] 重组菌NZ-X成功实现β-1,4-内切木聚糖酶的分泌表达,摇瓶发酵上清液酶活为5.33 U/mL,信号肽筛选结果发现YlaE、YfhK、EglS、YqxI、YpjP信号肽与β-1,4-内切木聚糖酶契合度较高,对应酶活依次为7.15、6.69、6.36、6.32、6.18 U/mL,其中SipS信号肽酶对融合YfhK信号肽的β-1,4-内切木聚糖酶的分泌促进作用最大,摇瓶发酵上清液酶活提高到10.64 U/mL,为NZ-X的1.99倍。[结论] 信号肽优化与信号肽酶过表达联用可有效提高B.subtilis中异源蛋白的分泌表达量。
    23  大熊猫精液和包皮菌群组成及潜在致病菌调查
    罗雪,刘颂蕊,马晓平,陈欣,李碧,邓泽帅,张东升,李运莉,苏小艳,李林,燕霞,侯蓉,曹随忠,岳婵娟
    2021, 61(10):3235-3248. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210017
    [摘要](56) [HTML](35) [PDF 619.89 K](47)
    摘要:
    [目的] 大熊猫是我国国家一级保护动物,其种群面临着传染病和栖息地破碎化等持续威胁,其中生殖系统的细菌感染和菌群失衡会影响大熊猫生殖健康,严重者可导致流产,是引起大熊猫繁殖障碍的原因之一。本研究对精液与包皮分泌物样本的菌群组成情况及分离培养潜在致病菌开展研究。[方法] 通过采集13份大熊猫包皮分泌物和12份精液样本,采用16S rRNA扩增子测序技术、细菌培养及PCR鉴定的方法,确定样本中的细菌种类。[结果] 菌群组成分析结果显示,在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)的细菌丰度在大熊猫包皮与精液中均为最高;在属水平上,不同时期的雄性大熊猫包皮的菌群可能会发生改变,棒状杆菌属(Corynebacterium)和Dolosicoccus是Ⅰ期包皮样本中最丰富的微生物菌群,相对丰度分别为15.45%和12.40%;链球菌属(Streptococcus)和埃希氏菌属(Escherichia)是Ⅱ期包皮样本中最丰富的微生物菌群,相对分度分别为37.94%和9.68%;拟杆菌属(Bacteroides)和普雷沃氏菌属(Prevotella)是精液样本中最丰富的微生物菌群,相对丰度分别为14.40%和12.88%。菌群多样性分析结果显示,精液样品高于Ⅰ期包皮样品和Ⅱ期包皮样品,Ⅰ期包皮样品和Ⅱ期包皮样品之间无显著差异。通过细菌分离培养得到肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)在内的多种潜在性致病菌。[结论] 本研究分析了大熊猫精液和不同时期包皮分泌物的菌群组成,其优势菌属存在差异,大熊猫包皮与精液中存在潜在性致病菌,这可能对大熊猫的生殖系统健康带来威胁,其致病性有待进一步研究。
    24  基于基因组的一株土壤固氮菌分离菌株鉴定及其促生作用
    靳海洋,王慧,张燕辉,胡天龙,林志斌,刘本娟,蔺兴武,谢祖彬
    2021, 61(10):3249-3263. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210021
    [摘要](65) [HTML](32) [PDF 661.01 K](75)
    摘要:
    [目的] 为获得高效固氮菌株,充分研究利用土壤固氮菌资源。[方法] 选取固氮能力较高的紫色土发育水稻土,采用富集纯化法分离固氮微生物菌株。通过16S rRNA基因系统发育分析和全基因组相关指数比较对新分离菌株进行物种鉴定。采用乙炔还原法和15N2示踪法定量测定新分离菌株的固氮能力,通过培养特性和接种效果初步研究固氮菌株的促生作用。[结果] 从紫色土发育水稻土中分离得到1株可在无氮培养基上快速生长的菌株P208。基于16S rRNA基因和基因组92个核心基因的系统发育分析结果表明,新分离菌株P208与Azotobacter chroococcum IAM 12666T(=ATCC 9043T)系统发育距离最近(16S rRNA基因相似度为99.79%)。菌株P208与A.chroococcum ATCC 9043T的基因组平均核苷酸一致性(ANI)、平均氨基酸一致性(AAI)和数字DNA-DNA杂交值(dDDH)高于物种分类阈值(ANI>;95%-96%,AAI>;95%-96%,dDDH>;70%),最大唯一匹配指数(MUMi)低于物种分类阈值(<;0.33),得出新分离菌株P208为褐球固氮菌(A.chroococcum)。A.chroococcum P208固氮活性为模式菌株A.chroococcum ATCC 9043T的2.61倍。除固氮能力外,A.chroococcum P208具有IAA生成、溶磷活性和铁载体生成等促进植物生长潜力的培养特性,室内培养条件下接种A.chroococcum P208能够促进水稻、小麦幼苗根系的生长。[结论] 从固氮能力较强的水稻土中分离纯化得到1株具有较强固氮、促生潜力的固氮菌,具有潜在的开发应用价值,可为研究利用生物固氮提供微生物资源。
    25  巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用研究
    朱伟峰,陈露,王芳,胡波,陈萌萌
    2021, 61(10):3264-3275. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210025
    [摘要](24) [HTML](57) [PDF 650.77 K](37)
    摘要:
    巴氏杆菌(主要是多杀性巴氏杆菌)可以引起多种动物疫病(巴氏杆菌病),同时也引起人类感染发病。[目的] 研究巴氏杆菌糖酵解酶对宿主细胞(兔肾细胞)和两种常见分子[纤连蛋白(fibronectin,Fn)和血浆纤维蛋白溶解酶原(plasminogen,Plg)]的黏附作用。[方法] 采用原核表达系统对多杀性巴氏杆菌的糖酵解酶进行表达并纯化及制备多克隆抗体,通过菌体表面蛋白定位检测、黏附与黏附抑制等实验探究巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用。[结果] 菌体表面蛋白检测结果显示除烯醇化酶和丙酮酸激酶外的7个糖酵解酶在多杀性巴氏杆菌表面存在。这7个糖酵解酶均能黏附兔肾细胞,但仅有磷酸葡萄糖异构酶的多克隆抗体能对多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞产生抑制作用。Far Western blotting结果显示9个糖酵解酶均能结合宿主Fn和Plg。招募抑制实验结果显示磷酸葡萄糖异构酶、醛缩酶、磷酸甘油酸变位酶的抗体对多杀性巴氏杆菌结合Fn和Plg都有抑制作用,磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶抗体仅对多杀性巴氏杆菌结合Fn或Plg有抑制作用。[结论] 多杀性巴氏杆菌糖酵解酶成员葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶、磷酸甘油酸变位酶在多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞或分子过程中发挥作用。该研究的完成将加深巴氏杆菌病分子发病机制的认识,并为巴氏杆菌病的诊断标识筛选、新型疫苗创制和药物靶标筛选等提供基础数据。
    26  番茄青枯病拮抗菌的定向筛选及其抗病促生机制研究
    徐欣韵,王宁,丁佳,陈妍,田光明
    2021, 61(10):3276-3290. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210033
    [摘要](54) [HTML](87) [PDF 1.02 M](96)
    摘要:
    [目的] 从抑病型番茄根际土壤中筛选青枯病的高效拮抗促生菌,阐明其防病促生机制。[方法] 以番茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为靶病原菌,采用平板抑菌圈法,筛选拮抗菌;通过BOX-PCR指纹图谱鉴定菌株多样性,以平板透明圈法评价其产酶活性,并针对抑菌能力强、产酶种类多的拮抗菌开展16S rRNA基因系统发育分析;通过温室试验评价拮抗菌的防病促生能力,并在此基础上通过实时荧光定量PCR研究生防细菌对番茄青枯病的防病促生机制。[结果] 从番茄根际土壤分离获得29株细菌,其中15株对青枯菌具有拮抗功能,进一步通过BOX-PCR指纹图谱、酶活分析获得4株具有潜在防治番茄青枯病、促进生长的功能菌(B2、B5、B20、B23),通过16S rRNA系统发育分析鉴定B2拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),B5和B20拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),B23拮抗菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);温室试验表明,B2、B5、B20、B23拮抗菌的抑病效果分别为35.59%、8.47%、32.20%、96.61%,并且均能显著增加番茄生物量和生理性状,如地上部鲜重、总叶绿素含量、地下部根尖数等。B2、B5、B23拮抗菌显著促进番茄株高和根长,B2、B20、B23拮抗菌显著增加茎粗;而B23拮抗菌显著增加根系分叉数;实时荧光定量分析表明,B2、B20、B23拮抗菌株可促进抗病相关功能基因PR1αPOD1的表达量,B2、B5、B23拮抗菌促进吲哚乙酸(IAA)信号通路应答关键基因ctd1的表达量,B2、B5、B20、B23拮抗菌均降低乙烯(ETH)信号通路应答关键基因ERF2的表达量。[结论] 本研究分离筛选获得4株对番茄青枯病具有显著防治效果以及促进番茄生长的PGPR菌株,可为定向筛选植物促生防病菌提供理论依据。
    27  不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5在有丝分裂中的分子动力学研究
    李慧,杨彤,陈茜,白鑫,丁祥
    2021, 61(10):3291-3304. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210035
    [摘要](30) [HTML](44) [PDF 879.44 K](39)
    摘要:
    [目的] 探究不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5蛋白在有丝分裂中的分子动力学变化。[方法] 本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为材料,采用活细胞成像的方法,探究Cdc5蛋白在不同温度下在酿酒酵母有丝分裂过程中的精细分子动力学变化;通过测量OD595绘制生长曲线图,看其宏观的分裂情况是否与微观下Cdc5蛋白的分子动力学变化一致;利用流式细胞术检测细胞的细胞周期变化的情况。[结果] 在胞质分裂时,Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞,并在芽颈处发生聚集。25℃条件下细胞中Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间长,37℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处聚集时间短,两者间存在显著差异;但两个温度下,细胞中Cdc5蛋白的表达量没有显著性差异。同时,温度也会影响Cdc5蛋白在降解过程中的动力学行为,包括Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中荧光强度峰值出现的次数和时间。生长曲线结果显示,酿酒酵母单一细胞分裂周期的变化影响了其宏观的细胞生长,且酵母分裂速度越快,子细胞长宽比越小;细胞周期结果表明,37℃下Cdc5蛋白的动力学变化与酿酒酵母细胞周期变化一致,酿酒酵母细胞周期从G0/G1期进入S期,亦加速了酿酒酵母的分裂。[结论] 本研究首次探究了不同温度下酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的精细分子动力学及对应的酵母的宏观生长情况,结果表明温度会对Cdc5蛋白的动力学产生影响,且其精细分子动力学与酿酒酵母的分裂速度成正相关,该结果为进一步研究其在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。
    28  组织蛋白酶S抑制塞内卡病毒在IBRS-2细胞中的复制
    史喜绢,张婷,杨博,申超超,张大俊,陈学辉,崔卉梅,袁兴国,赵登率,张克山,郑海学,刘湘涛
    2021, 61(10):3305-3314. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210045
    [摘要](28) [HTML](36) [PDF 423.77 K](38)
    摘要:
    [目的] 本研究旨在探究猪源组织蛋白酶S (cathepsin S,CTSS)对塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)复制的影响。[方法] SVV感染IBRS-2细胞,采用RT-qPCR在转录水平探究SVV感染对内源性CTSS表达的调控;采用ELISA测定SVV感染对CTSS酶活性的影响;通过Western blotting (WB)和RT-qPCR检测过表达CTSS对SVV复制及SVV诱导的抗病毒细胞因子的调控作用;合成针对CTSS的特异性siRNA,利用WB和RT-qPCR检测siRNA对CTSS的干扰效果以及CTSS被干扰后对SVV复制的影响。[结果] 结果表明SVV感染IBRS-2细胞能显著上调内源性CTSS表达并增强CTSS酶活性;过表达CTSS能显著抑制SVV在IBRS-2细胞中的复制,同时促进宿主抗病毒细胞因子的表达;siRNA-2947下调内源性CTSS表达进而促进SVV复制。[结论] CTSS通过增强宿主抗病毒细胞因子上调表达而抑制SVV复制,本研究为进一步深入探究宿主CTSS在抗SVV免疫应答中的作用及机制提供参考依据。
    29  过表达PDI对毕赤酵母分泌淀粉样蛋白的影响——以胱抑素为例
    牛婷婷,周雪洁,余小波,蔡宜生,陈静,王瑞,付爽,栾闯,何剑为
    2021, 61(10):3315-3327. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210049
    [摘要](23) [HTML](35) [PDF 865.98 K](41)
    摘要:
    [目的] 本研究旨在结合酵母菌蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)与其底物蛋白鸡胱抑素C (chicken cystatin C,cC)在酵母中的共表达,理解PDI影响外源蛋白合成与表达的调控规律。运用转录组深度测序技术(RNA-Seq)筛选差异基因,调取并鉴定影响cC表达的关键基因,为解析外源蛋白高效表达机制,改造工程菌株提供理论支撑。[方法] 以巴斯德毕赤酵母GS115、GS115-cC为出发菌株,采用电转的方法将携带PDI编码基因的载体pPIC3.5K转入到GS115/GS115-cC菌株,使其在菌株中过表达,研究过表达PDI对cC表达的影响。采用RNA-Seq深度测序方法,研究重组毕赤酵母基因表达差异情况。并结合KEGG注释结果对数据进行分析,挑选差异显著表达基因进行验证,初步明确其在蛋白表达调控方面的功能。[结果] 本研究通过构建过表达PDI重组毕赤酵母菌株,使得外源蛋白cC的表达量显著增加。利用RNA-seq技术分析过表达PDI菌株与正常菌株的差异,最终筛选了373个差异表达基因,其中有122个差异基因注释到KEGG生物通路,包括12个基因注释到蛋白质转运和分解代谢途径,21个基因注释到蛋白质折叠分选和降解途径,以及24个基因参与蛋白质的翻译途径等。[结论] 在毕赤酵母中过表达PDI能显著增加外源蛋白cC的表达量。通过对过表达与正常表达PDI的毕赤酵母基因的表达谱分析,初步确定了其中一些转录情况变化显著的基因,明确了它们参与的细胞途径和信号通路,为改造具有高效率表达淀粉样蛋白的酵母菌株奠定基础。
    30  乳白耙齿菌F17好氧降解四溴双酚A的特性及机理研究
    陈婕,吴涓
    2021, 61(10):3328-3339. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210053
    [摘要](32) [HTML](60) [PDF 684.31 K](51)
    摘要:
    [目的] 为了探究乳白耙齿菌F17(Irpex lacteus F17)降解溴代阻燃剂的可能性,研究了该菌好氧降解四溴双酚A (Tetrabromobisphenol A,TBBPA)的特性以及影响降解的因素,并结合降解产物的分析,推测其降解途径。[方法] 采用高效液相色谱法测定TBBPA的浓度,并通过气相色谱-质谱联用仪分析降解过程的中间产物。[结果] I.lacteus F17可以通过共代谢的方式好氧降解TBBPA,最适共代谢基质是葡萄糖。在葡萄糖浓度为8 g/L、菌悬液接种量为5%、pH 5.0的优化条件下,当TBBPA初始浓度为20 mg/L时降解率可达85.5%,脱溴率为14.6%。对降解过程中锰过氧化物酶的研究发现TBBPA的降解率受到该酶活性的影响。通过气相色谱-质谱联用仪检测到7种中间产物。[结论] I.lacteus F17可以有效降解四溴双酚A,其降解机理主要包括脱溴、β-断裂、羟基化、去质子和氧化等过程。

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