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微生物学报

  • 2017年第57卷第7期文章目次
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    • 封面

      2017, 57(7):0-0.

      摘要 (476) HTML (142) PDF 327.16 K (557) 评论 (0) 收藏

      摘要:

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      2017, 57(7):0-0.

      摘要 (468) HTML (171) PDF 748.42 K (895) 评论 (0) 收藏

      摘要:

    • >小型综述
    • 肠道微生物调控宿主食欲的研究进展

      2017, 57(7):951-960. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160399

      摘要 (1499) HTML (563) PDF 666.86 K (3396) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠道微生物与宿主代谢相互作用,可调节机体的生理功能。宿主机体中存在"微生物-肠道-大脑轴",肠道菌群可通过多种途径影响中枢神经系统,进而对宿主摄食等行为产生影响。食物中不易被宿主消化吸收的膳食纤维等营养物质,被肠道微生物发酵可产生多种代谢产物,这些代谢产物作为信号分子可通过不同途径介导中枢神经系统,进而调控宿主食欲。本文主要综述了肠道微生物及其代谢产物对中枢神经系统与宿主食欲的影响及其可能的调控途径与机制,以加深肠道微生物在调控宿主食欲方面的新认识。

    • 分枝杆菌毒素——分枝杆菌内酯与布鲁里溃疡

      2017, 57(7):961-968. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160435

      摘要 (873) HTML (586) PDF 695.71 K (1527) 评论 (0) 收藏

      摘要:溃疡分枝杆菌感染会导致慢性皮肤疾病布鲁里溃疡,引起组织坏死、细胞凋亡和免疫抑制等,感染前期患处会失去痛感从而往往使患者延迟其治疗。聚酮类分子分枝杆菌内酯是其细胞毒性的物质基础,也是分枝杆菌产生的主要毒素,对于免疫细胞和非免疫细胞都具有细胞毒性。本文综述了分枝杆菌内酯的结构、细胞毒性作用和分子靶点等,并提出了有待研究的问题以及研究意义。

    • 动物血红素过氧化物酶参与细菌氧化Mn(II)的研究进展

      2017, 57(7):969-977. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160523

      摘要 (930) HTML (318) PDF 700.39 K (1607) 评论 (0) 收藏

      摘要:锰氧化物是自然环境中一种重要的高活性矿物,在多种元素的生物地球化学循环中起着重要作用。细菌对锰氧化物的形成具有推动作用。截至目前,研究者已从环境中分离出多株锰氧化细菌,并在氧化机理的研究上取得了一定的进展。目前细菌中已知的锰氧化酶包括多铜氧化酶和动物血红素过氧化物酶。与多铜氧化酶相比,动物血红素过氧化物酶在蛋白结构与氧化方式上都具有自己的特点。本文结合国内外最新研究结果,在氧化菌株、氧化酶和基因、氧化方式及影响因素等方面对动物血红素过氧化物酶参与细菌氧化Mn(Ⅱ)的研究进行了总结,对未来研究方向进行了展望。

    • MKP-1在结核分枝杆菌感染中的作用和研究进展

      2017, 57(7):978-984. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20170014

      摘要 (778) HTML (551) PDF 553.01 K (1512) 评论 (0) 收藏

      摘要:有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)信号通路是细胞感知外源性刺激并作出有效免疫应答的最重要的细胞内信号通路之一。近年来的研究表明:MAPK的表达异常与结核病的发生、发展密切相关。MAPK磷酸酶(MAPK phosphatases,MKPs)是一类在细胞内水解MAPKs家族的磷酸酶,通过负向调控MAPKs的活性,从而在调节细胞的应激、分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要的作用,其中MKP-1是MKPs家族中被报道最多的成员,具有最强的去磷酸化能力。本文综述了MKP-1在结核分枝杆菌感染中的作用和研究进展。

    • >研究报告
    • 基于高通量测序技术分析使它隆对玉米土壤细菌多样性的影响

      2017, 57(7):985-993. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160346

      摘要 (1143) HTML (518) PDF 700.89 K (1774) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]研究使它隆对玉米土壤细菌多样性的影响。[方法]利用Illumina Miseq高通量测序技术,分别测定了玉米土壤细菌的16S rRNA基因的V4-V5可变区序列,进而对不同时期的不喷施除草剂和喷施除草剂的玉米土壤中细菌群落组成和多样性进行分析。[结果]研究共获得260940条有效序列,167191条优质序列,12656个OTUs。多样性分析结果表明,使它隆处理10 d后的土壤细菌多样性和丰度降低;使它隆处理60 d后的土壤细菌多样性和丰度提高。对土壤细菌群落组成分析发现,5个土壤样品中的优势菌门均为酸酐菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门。使它隆处理10 d后的样品酸杆菌门的比例增加,放线菌门和绿弯菌门的比例降低;使它隆处理60 d后样品变形菌门的比例降低,绿弯菌门的比例明显增加。[结论]使它隆对玉米土壤细菌多样性产生一定影响,其影响随施药时间而异。

    • 口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制I型干扰素信号通路的激活

      2017, 57(7):994-1003. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160368

      摘要 (638) HTML (604) PDF 748.95 K (1383) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对I型干扰素信号通路的影响。[方法]通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。[结果]成功构建了pCAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4-6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P<0.01或P<0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P<0.01或P<0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P<0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。[结论]证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制I型干扰素信号通路的激活。

    • 可用于辅助蛋白功能研究的人呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

      2017, 57(7):1004-1013. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160374

      摘要 (786) HTML (293) PDF 736.47 K (1428) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用。[方法]利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析。[结果]成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSVⅡ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性。[结论]以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性。

    • 理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体

      2017, 57(7):1014-1025. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160386

      摘要 (896) HTML (474) PDF 687.61 K (1678) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]借助蛋白质工程技术提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA的热稳定性,以期更好地将其应用于工业生产中。[方法]利用YASARA、FoldX、Rosetta、Gromacs等生物信息学软件,构建1个脂肪酶LipA的热稳定性提高的微型突变体电子文库;通过对突变体的结构信息和自由能变化进行评估,筛选出潜在的有价值的突变体。继而利用基因定点突变技术,构建上述候选突变体的突变基因文库,通过实验筛选出热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。[结果]利用上述方法,从构建的20个脂肪酶LipA突变体中,筛选到热稳定性有显著提高的3个突变体LipA-Asn125Asp、LipA-Asn125Glu和LipA-Gln262Glu。经55℃处理12 min后,上述3个突变体的T5012值较野生型分别提高4.0℃、5.5℃和4.4℃;在55℃下的半衰期较野生型分别提高了2.2倍、3.8倍和2.6倍。[结论]利用生物信息学软件,构建脂肪酶LipA突变体电子文库,结合蛋白质的结构信息,可以快速筛选到热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。

    • 双歧杆菌对中国对虾原肌球蛋白致敏小鼠的免疫调控作用

      2017, 57(7):1026-1037. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160390

      摘要 (791) HTML (539) PDF 805.00 K (1423) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]比较研究婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis 13.085)对中国对虾原肌球蛋白致敏BALB/c小鼠预防与治疗过敏反应的差异,探究其对致敏小鼠Treg/Th17细胞平衡及相关细胞因子的影响。[方法]采用硫酸铵盐析及等电点沉淀法纯化中国对虾原肌球蛋白(TM),将中国对虾TM和弗氏佐剂混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验小鼠随机分为正常对照组、治疗对照组、双歧杆菌治疗组、预防对照组和双歧杆菌预防组。观察分析小鼠过敏症状(腹泻、肺组织HE染色比较、称重法测定小鼠体重和脾脏脏器系数变化),采用ELISA测定小鼠血清中特异性IgE、IgG2a和组胺的含量,采用流式细胞术测定脾脏T淋巴细胞亚群(Treg、Th17)数量,采用荧光定量PCR测定脾脏中Treg型和Th17型细胞因子和转录因子的表达量。[结果]纯化得到中国对虾原肌球蛋白纯度为84.93%,得率为60.88%。体内试验表明,双歧杆菌治疗组和预防组相比于对照组,腹泻和过敏症状均有明显的缓解;不同时期的双歧杆菌干预均对过敏小鼠肺组织症状有明显的改善作用,且可降低过敏小鼠的脾脏脏器系数。第56天实验周期结束后发现,相比预防对照组和治疗对照组,双歧杆菌预防组和治疗组小鼠血清中特异性IgE和组胺含量显著降低(P<0.05),脾脏Treg/Th17比值显著升高(P<0.05),Th17型细胞因子IL-17A mRNA表达水平显著降低(P<0.01);双歧杆菌治疗组相对于治疗对照组,Treg型细胞因子CD25 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。此外,双歧杆菌治疗组血清特异性IgE及IL-17A mRNA转录水平显著低于双歧杆菌预防组(P<0.05),而Treg/Th17比值及CD25 mRNA转录水平显著高于预防组(P<0.05)。[结论]双歧杆菌13.085能有效缓解小鼠过敏症状,且治疗免疫调控效果优于预防效果,其作用可能通过平衡Treg/Th17细胞亚群数量,促进Treg型细胞因子表达而抑制Th17型细胞因子分泌,从而阻断炎性抗体及组胺释放。

    • 基于转录组分析的染色体大片段缺失及其对井冈霉素高产菌株的影响

      2017, 57(7):1038-1048. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160392

      摘要 (1038) HTML (470) PDF 728.31 K (1386) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]测试大片段删减低转录区域对菌体生长和井冈霉素产量的影响。[方法]通过转录组分析,选择染色体上连续的基因低转录区域进行大片段缺失,通过Cre-loxP位点特异性重组得到1.2 Mb片段缺失突变株LCY-4。HPLC检测缺失株井冈霉素产量的变化,并测定干重绘制生长曲线。[结果]通过转录组分析,我们在井冈霉素高产菌株TL01染色体左侧末端发现了1.9 Mb的连续基因低转录区,使用Cre-loxP系统对其中的1.2 Mb区域进行大片段缺失,成功得到了1.2 Mb缺失突变株LCY-4。和出发菌株TL01相比,缺失突变株LCY-4中井冈霉素发酵产量基本保持不变,生物量有显著提高,最高增幅达到44%。[结论]1.2 Mb区域的成功缺失,意味着基于转录组分析寻找连续的基因低转录区域并加以缺失的策略的可行性。1.2 Mb片段缺失对菌体生物量积累具有明显促进作用,为后续将其开发成氨基环醇类药物异源表达的通用高产宿主奠定了基础。

    • 枸杞根际土壤真菌群落多样性的高通量测序

      2017, 57(7):1049-1059. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160410

      摘要 (1181) HTML (607) PDF 709.57 K (2208) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]为了解不同枸杞产区枸杞根际真菌多样性的差异,从枸杞根际土壤真菌群落的角度试图解释宁夏枸杞优良品质与其土壤微生物菌群的联系。[方法]采用MiSeq高通量测序方法,分别将我国4个不同地区枸杞根际土壤样品进行ITS区的高通量测序,并分析了物种组成和丰度、Alpha多样性、Beta多样性和菌群结构,测定不同产区枸杞主要有效成分,同时对枸杞品质和其土壤理化因子及枸杞根际真菌种群多样性的相关性做了分析。[结果]多糖含量和甜菜碱含量均是中宁枸杞高于兴仁和精河,格尔木含量最低;宁夏兴仁、宁夏中宁、新疆精河3个地区菌群结构类似,子囊菌门和结合菌门占总菌群的80%左右,而青海格尔木除了子囊菌门占58%外,壶菌门和新丽鞭毛菌门远远高于其他3个地区,比例占总菌群的近25%;4个地区枸杞根际土壤真菌菌群结构相似性依次为宁夏兴仁、新疆精河、宁夏中宁、青海格尔木。[结论]枸杞根际土壤样品真菌物种组成丰富,不同地区枸杞根际土壤真菌种群结构有一定差异;枸杞主要有效成分含量与枸杞根际土壤真菌种群结构具有一定相关性。

    • 水环境中重金属铜对异育银鲫肠道微生物的影响

      2017, 57(7):1060-1068. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160414

      摘要 (825) HTML (492) PDF 732.21 K (1447) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]了解水环境中重金属铜对异育银鲫肠道微生物组成及多样性的影响。[方法]采用试剂盒提取异育银鲫肠道总DNA,然后对总DNA进行16S rRNA进行扩增,构建异育银鲫肠道微生物16S rRNA基因克隆文库,最后进行数据分析。[结果]厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为异育银鲫肠道中主要的细菌类群,在不同浓度的重金属铜胁迫处理后,厚壁菌门的含量明显降低。稀释性曲线、Venn图和多样性指数分析结果表明,重金属铜胁迫处理后异育银鲫肠道微生物多样性明显降低。[结论]重金属铜会使异育银鲫肠道微生物组成及多样性降低。此结果为研究重金属污染对异育银鲫健康状况的影响及异育银鲫养殖过程中病害的诊断奠定基础。

    • 重寄生真菌盾壳霉pH信号通路中Pal相关基因的功能鉴定

      2017, 57(7):1069-1082. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160443

      摘要 (729) HTML (514) PDF 887.76 K (1333) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]研究pH信号通路(Pal)在重寄生真菌盾壳霉与寄主核盘菌互作过程中的作用。[方法]从盾壳霉全基因组信息中分析获得了6个Pal相关基因CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF、CmpalHCmpalI的全编码序列和氨基酸序列,通过PEG介导的原生质转化技术获得了CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalFCmpalH等5个基因的敲除突变体,分析这些敲除突变体与野生型在菌落培养性状、重寄生能力、降解草酸能力、产生抗真菌物质能力等方面的差异。[结果]与野生型相比,在pH 6-8的条件下,5个Pal相关基因敲除突变体的菌丝生长受到显著抑制,这说明缺失Pal相关基因使盾壳霉对高pH值环境更加敏感。菌核重寄生试验发现5个Pal相关基因敲除突变体的重寄生能力均显著低于野生型。qRT-PCR试验结果表明,敲除Pal相关基因之后导致重寄生相关酶基因Cmch1、Cmg1和Cmsp1的表达量显著降低,而且pH信号通路下游的CmpacC基因的表达量也显著降低。Pal相关基因敲除突变体在pH 6条件下对草酸盐的降解能力显著高于野生型,同时这5个突变体在pH 8条件下产生抗真菌物质能力也显著高于野生型。[结论]pH信号通路相关基因的缺失影响盾壳霉对环境pH的响应。pH信号通路在盾壳霉与核盘菌互作中发挥重要作用,不仅影响盾壳霉的重寄生作用,而且还影响盾壳霉的草酸降解作用和抗真菌作用。

    • 喜温嗜酸硫杆菌SM-1在不同温度下基因组的可塑性

      2017, 57(7):1083-1094. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160445

      摘要 (706) HTML (585) PDF 679.27 K (1411) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]驯化得到喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)SM-1在低于最适生长温度下具有较高生长活力的突变菌株,并认知喜温嗜酸硫杆菌在不同温度下的基因组可塑性。[方法]利用实验室长期进化实验对菌株进行3个温度的驯化:37、40、45℃。运用454测序技术对驯化获得的菌株进行基因组重测序,通过比较基因组分析驯化株基因组单核苷酸位点变化(SNPs),对包含位点变化的基因从功能上进行分类,在此基础上,分析可能与温度适应性相关的基因。[结果]通过不同温度下的长期驯化,得到了在低于最适生长温度下具有较高活力的菌株;重测序结果发现,SM-1基因组具有较好的可塑性,不同温度(37、40、45℃)生长的菌株中,基因组中分别有418、384和347个核苷酸位点发生累计变化,其中3个温度下有20个相同的非同义突变位点,分别分布于编码重金属和毒性抗性系统、DNA甲基化和蛋白乙酰化酶、核酸代谢相关酶类等相关基因上;相比而言,在低于最适生长温度(37、40℃)下生长菌株特有的位点变化涉及能量代谢、信号转导以及DNA/RNA稳定性相关基因;其中,2个低温菌株共同发生位点变化的基因有3个,其中两个编码转座相关的蛋白Atc_1031与Atc_1623,另一个编码假想蛋白Atc_1130,该蛋白分别与外膜蛋白组装因子B和二硫键形成蛋白具有23%和35%的相似性。另外,不同生长温度下相关蛋白中氨基酸的组成也发生变化。[结论]喜温嗜酸硫杆菌SM-1基因组具有较好的可塑性,对于其基因组变化的研究结果为认识微生物温度适应性提供了组学数据。本研究揭示喜温嗜酸硫杆菌(At.caldus)SM-1可能通过多种途径适应向低温过渡生长,既包括微生物通用的环境适应机制,也存在菌株特有的温度适应途径。

    • Marinacarbolines甲基化基因mcbD的筛选及其功能

      2017, 57(7):1095-1105. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160450

      摘要 (907) HTML (463) PDF 718.42 K (1561) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]定位Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组中负责marinacarbolines甲基化修饰的基因mcbD并鉴定其功能。[方法]游离M.thermotolerans SCSIO 00652的基因组序列中功能注释为甲基转移酶的蛋白,使用MEGA 6自带的ClustalW与来自于marformycins生物合成途径中的MfnG(D/L-酪氨酸甲基化酶)进行多序列比对,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,筛选到与MfnG进化关系最近的Orf03255(McbD);扩增mcbD后克隆至pET28a(+)并在E.coli BL21(DE3)中表达,结合Ni-NTA亲和层析法纯化获取较高纯度的McbD活性蛋白;以marinacarboline B为底物,利用高效液相色谱检测McbD的体外酶活;利用基于PCR-targeting的遗传操作体系构建mcbD插入失活突变株(ΔmcbD)并分析其与野生型菌株的发酵产物差异。[结果]N-末端融合组氨酸标签的McbD蛋白在E.coliBL21(DE3)中可溶性表达,亲和层析纯化的McbD能够以marinacarboline B为底物催化形成marinacarboline C;mcbD基因阻断突变株ΔmcbD与野生型相比不产生化合物marinacarboline C,同时累积marinacarboline B。[结论]McbD为marinacarbolines生物合成中必需的O-甲基转移酶。

    • 甲烷菌对厌氧真菌不同碳源代谢的影响

      2017, 57(7):1106-1111. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160453

      摘要 (739) HTML (662) PDF 651.35 K (1283) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]探讨碳源和甲烷菌对厌氧真菌碳代谢的影响。[方法]利用体外批次厌氧发酵法,比较厌氧真菌纯培养(Orpinomyces sp.和Neocallimastix sp.)及其与甲烷菌共培养(F1:Orpinomyces sp.+Methanobrevibacter sp.和N3:Neocallimastix sp.+Methanobrevibacter sp.)发酵不同类型碳水化合物代谢产物的差异。[结果]对厌氧真菌和甲烷菌共培养F1和N3的研究显示,F1发酵木薯粉[(26.44±0.22)mmol/L]的乳酸产量是发酵玉米芯[(1.31±0.04)mmol/L]的20.18倍,是N3发酵木薯粉[(1.59±0.03)mmol/L]的16.63倍,玉米芯[(0.79±0.08)mmol/L]的33.47倍。当F1和N3中的厌氧真菌纯培养时,各组乳酸产量均 <1.90 mmol/L。对F1进一步研究,结果显示发酵体系中木薯粉添加量在0.8%-2.0%之间时,乳酸产量随木薯粉添加量增加而增加。当含量在1.0%-2.4%之间时,随木薯粉添加量增加,甲烷和乙酸产量逐渐降低。比较F1发酵大米粉、木薯粉、玉米粉、小麦粉和土豆粉的发酵结果,发现乳酸产量与底物中支链淀粉的含量成正相关(R2=0.9554)。当F1发酵葡萄糖和麦芽糖时,乳酸产量 <5.00 mmol/L。当以麦芽糊精为底物时,乳酸产量高达(28.00±0.95)mmol/L。[结论]本文首次报道碳源和甲烷菌能够增强厌氧真菌的乳酸代谢途径并且这种增强存在种属特异性。

    • 大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

      2017, 57(7):1112-1125. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160456

      摘要 (997) HTML (652) PDF 759.97 K (2220) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD+菌株,对于NAD+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。[方法]首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD+合成途径中的关键酶基因pncB、nadDnadE;其次,通过外源调节增加NAD+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD+积累量的影响,确定最佳的优化条件。[结果]根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coliBL21/pET-21a-nadE-pncB胞内NAD+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15-20℃,OD600为0.6-0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD+含量在最优条件下实验验证值可达43.16 μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。[结论]在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncBnadE,胞内NAD+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。

    • 两步PCR介导的Red重组技术快速敲除鼠疫耶尔森菌sRNA及染色体大片段

      2017, 57(7):1126-1137. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20170008

      摘要 (909) HTML (509) PDF 738.80 K (1651) 评论 (0) 收藏

      摘要:[目的]利用Red同源重组系统,通过二步PCR法建立一种适合鼠疫耶尔森菌sRNA和大片段染色体基因敲除的方法。[方法]第一步PCR先扩增出目的基因的上、下游同源臂(600-1000 bp)及卡那抗性盒,再以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩尔混合物为模板,通过融合PCR获得含上下游同源臂及卡那抗性盒的线性突变盒,再将此突变盒的PCR产物电转到含有pKD46质粒的鼠疫201菌株,在阿拉伯糖的诱导下,pKD46质粒表达Red重组酶,促使卡那抗性盒替换目的基因,最后对获得的重组克隆进行PCR鉴定。[结果]本研究通过两步PCR法构建600-1000 bp的同源臂,提高了同源重组效率,并将鼠疫菌sRNA RyhB1(108 bp)和RyhB2(106 bp)和染色体大片段47-2(10.4 kb)、47-3(21.6 kb)、47-3a(9.2 kb)及47-3b(6.1 kb)成功敲除。[结论]基于Red重组系统构建的二步法突变技术,是一种简单、高效的精确修饰鼠疫菌sRNA及大片段染色体的方法,适合于鼠疫菌全基因组的基因敲除,为鼠疫菌基因表达与调控、致病和毒力等研究提供有力的工具。

    • >学科先贤
    • 杨克迁研究员的链霉菌研究历程

      2017, 57(7):1138-1139.

      摘要 (634) HTML (445) PDF 501.53 K (2816) 评论 (0) 收藏

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