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微生物学报

  • 2008年第48卷第5期文章目次
    全 选
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    • >学科先贤
    • 我国农业微生物学的先驱——张宪武

      2008, 48(5).

      摘要 (881) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1372) 评论 (0) 收藏

      摘要:

    • >小型综述
    • 含奥氏酮嗜盐紫色硫细菌的分离鉴定及系统发育分析

      2008, 48(5):571-576.

      摘要 (1754) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2052) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】为挖掘我国紫色硫细菌物种和光合蛋白基因资源。【方法】采用Pfennig紫色硫细菌无机选择性培养基和琼脂稀释法。【结果】从青岛东风盐场分离获得一株含奥氏酮、耐高浓度硫化物、嗜盐耐碱紫色硫细菌菌株283-1。该菌株能氧化硫化物产生硫粒储存在细胞内、嗜盐、细胞含有奥氏酮类胡萝卜素、细菌叶绿素a强吸收峰位于830 nm处、运动、不产生气囊,表明属于Marichromatium属,16S rDNA序列同源性比较和系统发育分析也表明这一点。但该菌株能在1%~15% NaCl、7.5 mmol/L高浓度硫化物、45℃、5000lux、pH9.0条件下生长良好,能很好的光同化C3和C4有机酸和葡萄糖酸钠等特性,与Marichromatium属4个种有明显不同。 【结论】菌株283-1是Marichromatium属一个新分离物,编号 Marichromatium sp. 283-1。

    • 代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus菌株

      2008, 48(5):577-582.

      摘要 (1131) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2067) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】对分离自猪肠道的乳酸杆菌S1菌株进行鉴定,并比较该菌株与同种的001T菌株的基因差异。【方法】对S1菌株进行16S rRNA基因序列分析和种特异PCR检测,并且对S1菌株和Lactobacillus sobrius 001T进行代表性差异分析(Representational difference analysis,RDA)。【结果】16S rRNA基因序列分析表明,与S1菌株最相似的已知菌为L. sobrius。变性梯度凝胶电泳分析显示,仔猪空、回肠细菌图谱中有一与S1菌株有相同迁移位置的优势条带,克隆、测序鉴定表明,与该条带相匹配的16S rRNA基因克隆(Clone S)的最相似已知菌也为L. sobrius。16S rRNA基因系统进化分析表明,S1菌株与Clone S和L. sobrius 16S rRNA基因序列同源性分别为99.8%和99.6%。L. sobrius特异性引物也可以扩增S1株菌的16S rRNA基因的特定片段。因此S1菌株可被确定为L. sobrius。RDA对菌株S1和同种的猪源L.sobrius 001T菌株的基因差异进行分析,未发现这两株菌的基因组差异。【结论】猪肠道乳杆酸菌S1菌株属于L. sobrius,其与猪源L. sobrius 001T菌株为相似菌株。

    • >分类和进化
    • 登革2型病毒中国株3′非编码区RNA元件对翻译的影响

      2008, 48(5):583-588.

      摘要 (1218) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1903) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】探讨登革病毒(dengue virus,DEN)3′非编码区(untranslated region, UTR)RNA元件(VR、RCS2、CS2、CS1和SL)对基因组翻译的影响。【方法】首先构建登革2型病毒中国株(DEN2-43) UTR 与萤火虫荧光素酶基因(LUC)组成的病毒诱导报告基因(virus induced reporter gene, VIRG),在此基础上分别构建包含DEN2-43 3′UTR不同RNA元件的VIRG,并通过LUC检测、实时RT-PCR和Western blot方法分析含有不同元件VIRG对翻译效率的影响。【结果】发现完整的3′UTR缺失可显著抑制翻译,含有病毒VR元件VIRG的翻译水平与完整3′UTR的VIRG相似,RCS2或CS2元件可提高VIRG的翻译效率,CS1或SL元件可降低VIRG的翻译效率。【结论】DEN 2-43病毒基因组 3′UTR参与了报告基因的翻译,其不同元件具有可上调和下调报告基因翻译效率的作用。

    • >遗传和分子生物学
    • 一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定

      2008, 48(5):589-595.

      摘要 (2144) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2583) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】紫杉醇是重要的抗癌药物,主要从罗汉松等植物中提取,为了保护罗汉松等种质资源,本文从罗汉松植株中分离产紫杉醇内生真菌,并对内生真菌所产紫杉醇的抗肿瘤活性进行了分析。【方法】采用组织块法自罗汉松的根、茎、叶等组织中分离内生真菌;通过四唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium, MTT)比色法筛选有抗肿瘤活性的内生真菌菌株,通过薄层层析(Thin Layer Chro-matography, TLC)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)对内生真菌所产活性物质进行鉴定;采用抽提法抽提内生真菌所产紫杉醇,应用Vero细胞对抽提的紫杉醇的活性进行了分析。【结果】从罗汉松属(Podocrapus)植物中分离到155株内生真菌,其中28株内生真菌具有较高的抑癌活性。将其中一株菌株A2命名为EPTP-1,经形态学和分子分类学分析鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。菌株EPTP-1中抽提的紫杉醇5.553 mg/L~555.3 mg/L作用24h表现出明显的致细胞凋亡作用。菌株EPTP-1发酵5天时紫杉醇的产率为0.5578±0.0294 mg/L。【结论】从罗汉松中分离到了一株产紫杉醇内生真菌EPTP-1,可作为紫杉醇类药物工业化生产的候选菌株。

    • 一株寄生油松毛虫的白僵菌毒素化学成分

      2008, 48(5):596-601.

      摘要 (1226) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1910) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】从一株寄生于油松毛虫(Dentrolimus tabulaeformis Tsai et Liu)越冬幼虫上的高毒力卵孢白僵菌(Beauveria tenella )的发酵液中,分离纯化出对油松毛虫幼虫具有杀虫活性的毒素物质。【方法】对这株白僵菌进行了液体培养,用乙酸乙酯对发酵液进行萃取,然后对粗提物进行了硅胶色谱分离, 利用GC/MS对第6组物质进行化学成分分析。【结果】其发酵液的乙酸乙酯粗提物对油松毛虫具有杀虫活性(校正死亡率42.52%)对粗提物进行了硅胶色谱分离,共得到6组物质,其中第6组物质对油松毛虫的校正致死率达80.26%。利用GC/MS对第6组物质进行化学成分分析,得知其包括17个组分,其中相对含量大于10%的有:2-哌啶酮占14.02%,2-香豆满酮占47.10%,六氢化-吡咯环[1,2-a] 吡嗪 -1, 4- 二酮占21.05%。用其中的2-哌啶酮和2-香豆满酮分别作杀虫试验,油松毛虫的校正死亡率分别为83.32% 和91.61%。【结论】2-哌啶酮和2-香豆满酮是该白僵菌菌株的代谢毒素物质。

    • >生理和代谢
    • 球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性

      2008, 48(5):602-607.

      摘要 (1303) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1486) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因。杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能。【方法】通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41 pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究。【结果】证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960 bp核苷酸组成,表达42 kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DF1020代谢糖的能力。【结论】杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础。

    • 线粒体型蛋白frataxin在家蚕微孢子虫中的鉴定与分析

      2008, 48(5):608-615.

      摘要 (1241) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2119) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】Frataxin 是铁硫簇相关蛋白,在线粒体代谢中起着重要作用。分析家蚕微孢子中该蛋白的结构特征,系统进化关系以及在孢子体内的转录翻译活性。【方法】基于家蚕微孢子全基因组序列,同源序列搜索获得该基因序列。进行蛋白二级结构比较,近缘物种共线性特征分析及系统进化树构建。此外构建pGEX-4T-1-Nbfra原核重组表达载体,转化E. coli BL21(DE3)进行目的蛋白表达纯化,以此为抗原免疫小鼠,制备抗体,并与家蚕微孢子总蛋白进行Western免疫杂交。【结果】Nbfra蛋白缺乏进入线粒体的信号序列,功能区缺乏部分a-螺旋;frataxin基因在不同微孢子基因组中的分布具有共线性特征,表明其在基因组进化中非常保守。系统进化分析显示微孢子形成独立进化支,并且与高等真核生物近缘,说明微孢子在进化地位上比其它原虫更加高等,支持了微孢子虫是真菌的姊妹枝的进化地位假说。【结论】免疫杂交结果表明Nbfra基因家蚕微孢子虫中能正常表达与翻译。本研究为微孢子的分类地位及线体假说提供了重要的补充依据。

    • >酶和蛋白质
    • 贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性分析

      2008, 48(5):616-622.

      摘要 (1404) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2638) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】对实验室养殖条件下的重要经济昆虫冬虫夏草寄主—贡嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis, Hg)幼虫肠道微生物群落的多样性进行了研究。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rRNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得8个属的细菌类群,其中肠杆菌属(Enterobacter)是优势菌群,肉食杆菌属(Carnobacterium)是次优势菌群。对通过DGGE方法得到的11条16S rRNA优势条带序列进行了比对和系统进化树分析,结果表明肉食杆菌属(Carnobacterium)的丰度最高,是肠道细菌中主要的优势菌群,芽孢杆菌属(Bacillus)是次优势菌群。DGGE图谱还显示Hg幼虫不同虫龄肠道细菌菌群的结构存在差异,推测可能与其发育生理状态的差异有关系。【结论】结合常规分离法与DGGE法能够更有效的分析肠道微生物的多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息。

    • 桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1的分离鉴定及其内生定殖

      2008, 48(5):623-630.

      摘要 (1433) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2420) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】对从健康桑树叶片中分离到的一株内生拮抗细菌Lu10-1进行鉴定,并探讨该菌株在桑树体内的定殖。【方法】通过形态观察、生理生化指标测定及16S rRNA基因序列同源性分析,结合recA基因特异引物PCR检测法对菌株Lu10-1进行分类学鉴定;以抗利福平(Rif)和氨苄青霉素(Amp)双抗药性为标记,采用浸种、浸根、涂叶和针刺等方法接种,测定Lu10-1菌株在桑树体内的定殖。【结果】结果表明,菌株Lu10-1属于伯克霍尔德氏菌属 (Burkholderia),与亲缘关系较近菌株B. cepacia (X80284)的同源性达98%,该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为EF546394;Lu10-1菌株浸种接种后,菌株在桑苗组织中的数量总体上呈现下降趋势,到第20天后菌量趋于稳定;细菌浸根接种后,菌株在茎叶部定殖的菌量均呈现出“先增后降”的趋势。【结论】内生拮抗细菌Lu10-1归属于洋葱伯克霍尔德氏菌基因型Ⅰ(Burkholderia cepacia genomovarⅠ);该菌株可在桑树体内长期定殖并传导,且在定殖过程中菌株的拮抗性能未改变;为将该菌株导入桑树体内进行病害的生物防治提供了理论依据。

    • 烟草根际铁载体产生菌G-229-21T的筛选、鉴定及拮抗机理

      2008, 48(5):631-637.

      摘要 (1456) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2673) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】从烟草根际筛选烟草疫霉[Phytophthora parasitica var. nicotianae (Breda de Hann) Tucker]拮抗菌,探索其拮抗机理。【方法】限铁(2.0 mmol/L FeCl3)蔗糖-天冬酰胺平板对峙法筛选烟草疫霉拮抗菌;刃天青(CAS)法检测其铁载体的产生及其对铁离子的亲和能力。结合形态、生理生化、16S rRNA序列同源性和系统发育分析及种特异性分子法对其进行鉴定。XAD-2吸附层析法提取其铁载体,分光光度法检测其铁载体类型。不同铁离子浓度下,比较其铁载体对烟草疫霉的抑制作用。【结果】我们筛选到一株限铁条件下烟草疫霉拮抗菌G-229-21T,该菌产生高亲和力铁载体,被初步鉴定为Pseudomonas mediterranea。该菌产生的羧酸型铁载体,在低铁条件下(0.16 mmol/L~10 mmol/L FeCl3)对烟草疫霉的抑制率达92.3%以上,而在富铁条件下(100 mmol/L FeCl3)抑制率仅为2.0%。【结论】首次报道P. mediterranea G-229-21T产生高亲和力羧酸型铁载体,该铁载体在低铁条件下对烟草疫霉有显著的抑制作用。

    • >生态和环境微生物学
    • 置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响

      2008, 48(5):638-643.

      摘要 (1153) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1890) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)在病毒装配、出芽、释放及侵入宿主细胞的过程中发挥关键作用,但HN对病毒致病力的影响程度尚不完全清楚。【方法】为探讨这一问题,本研究以中等毒力毒株Mukteswar的HN基因替换我国广泛应用的LaSota疫苗株HN基因,通过反向遗传操作技术拯救出嵌合病毒(rL-MuHN)。【结果】rL-MuHN红细胞吸附能力较亲本株rLaSota无显著升高,具有相似的细胞融合活性;嵌合病毒ICPI由rLaSota株的0.36降为0,MDT≥90,IVPI=0与rLaSota株相同,保持典型低致病力缓发型特点不变。进一步以Mukteswar株F基因替换rL-MuHN的F基因,拯救出F和HN双基因替换嵌合病毒rL-MuFHN,尽管该病毒的细胞融合能力显著提高,但其MDT、ICPI和IVPI分别为98 h,0.59和0,显示F和HN双基因替换仍未能使嵌合新城疫病毒rL-MuFHN的致病力达到中等毒力毒株Mukteswar(MDT、ICPI及IVPI分别为46 h、1.32和0.64)的水平。【结论】试验结果表明,F及HN囊膜蛋白基因之外的病毒基因组骨架背景对病毒的致病性同样具有重要的决定性意义,不同HN蛋白对嵌合病毒的致病能力的影响不同,与供体毒株毒力无关;以流行野毒株HN替代rLaSota疫苗株构建抗原针对性更强的弱毒疫苗株存在技术可行性。

    • >技术与方法
    • 涅斯捷连科氏菌特异性引物PCR分子鉴定

      2008, 48(5):644-650.

      摘要 (1240) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1254) 评论 (0) 收藏

      摘要:涅斯捷连科氏菌属的建立基于对Micrococcus halobius的再分类,这是一类广泛分布于高盐土壤环境的革兰氏阳性细菌,属放线菌类。在对我国西部盐湖环境放线菌的生物多样性及分类学研究中,大量类似菌株被分离。【目的】为了对其进行快速鉴定,特别是筛选出属于优势类群的涅斯捷连科氏菌,【方法】本研究根据前人以报道的方法设计了一对针对其16S rRNA基因的特异性PCR引物(Nes1/Nes2),【结果】并通过部分典型菌和野生菌株的PCR实验验证,结合16S rRNA基因的测序验证,证明了Nes1/Nes2的PCR反应有效性及其对涅斯捷连科氏菌的特异性。【结论】利用该引物可以快速准确的对涅斯捷连科氏菌进行鉴定。

    • 应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌

      2008, 48(5):651-656.

      摘要 (1379) HTML (0) PDF 0.00 Byte (3177) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】枯草群芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)和短小芽孢杆菌(B. pumilus)是微生物肥料中常用菌种,用传统方法鉴定费时费力,有必要建立检测和鉴定这些芽孢杆菌的种特异性PCR方法。【方法】利用已登录的gyrA、rpoA和16S rRNA基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异引物并建立多重PCR反应体系。【结果】以基因组DNA为模板,扩增芽孢杆菌、类芽孢杆菌和短芽孢杆菌3属15种的标准菌株(共33株),4个目标种分别产生了大小不同的唯一的产物,除个别种与短小芽孢杆菌引物有交叉反应外,其余参考菌株均为阴性。从23株枯草群菌株的基因组DNA扩增发现,PCR鉴定与常规鉴定结果一致。【结论】本文建立的多重PCR方法具有较好的特异性,可快速准确鉴定枯草群的4个种,在微生物肥料检测方面有良好的实用前景。

    • 一种改进的平板影印工具及其应用

      2008, 48(5):657-660.

      摘要 (1665) HTML (0) PDF 0.00 Byte (3309) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】建立一种简便高效的平板影印工具,克服传统影印工具的缺陷。【方法】将大量竹签按照一定方法捆扎成与平皿内盖直径相近的捆,将单根牙签转移菌落的效果进行扩大,从而实现菌落的大规模转移。【结果】本实验室使用上述工具成功地进行了平板影印和传代,并进行转化子大规模筛选。【结论】与传统工具相比,该影印工具更为经济简便,而且效果清晰,为微生物平板筛选提供新的方法和思路。国家发明专利申请号:2007100291331。

    • >方法
    • 外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达

      2008, 48(5):661-666.

      摘要 (1333) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2145) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt中的稳定性较差,外源基因容易丢失。将基因整合入染色体是一种构建遗传性状稳定、杀虫活力高的Bt工程菌的有效方法。【方法】本研究采用PCR技术,分两段扩增定位于Bt无晶体突变株XBU001染色体上的trigger factor基因片段作为同源臂,克隆入温度敏感型载体pKSV7,构建了定点整合载体pKTF12。并利用pKTF12质粒将cry1Ac基因定点整合入XBU001染色体上。【结果】利用载体pKTF12将cry1Ac定点插入trigger factor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响。重组菌株KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体。与携带高拷贝外源质粒的Bt菌株HTX42相比较,KCTF12具有芽孢数量增多、芽孢形成期提前的优势。【结论】定点整合法是一种构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因Bt工程菌的有效方法。

    • 斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

      2008, 48(5):667-671.

      摘要 (1222) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1715) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异。【方法】用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长。【结果】cbh1基因全长为1500 bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602)。克隆并分析了1.9 kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CREⅠ与纤维素酶转录调控蛋白ACE Ι的两个的潜在结合位点。【结论】在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2。两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的。

    • 苏云金芽孢杆菌的cry2A芽孢期启动子和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa蛋白表达的影响

      2008, 48(5):672-676.

      摘要 (1837) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1618) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】分析苏云金芽孢杆菌的cry2A型芽孢期启动子对晶体蛋白Cry11Aa的协调作用和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa表达的促进功能。【方法】3个包括cry11Aa编码区的重组质粒pHcy1、pHcy2和pHcy4被构建并电激转化到苏云金芽孢杆菌晶体缺陷株4Q7中,其中pHcy1质粒携带cry11Aa基因自身启动子和分子伴侣p19基因,pHcy2携带cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因,pHcy4质粒在pHcy1的上游插入了cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因。SDS-PAGE分析了Cry11Aa蛋白在各重组苏云金菌株中的表达情况,并通过生物测定确定了其对蚊虫的生物活性。【结果】SDS-PAGE结果表明,Cry11Aa蛋白在4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)均获得了表达,在4Q7(pHcy2)中未检测到Cry11Aa蛋白,推测晶体蛋白Cry11A不能利用cry2A型启动子进行表达调控;Cry11Aa蛋白在等体积4Q7(pHcy4)培养液中的表达量是4Q7(pHcy1)菌株的1.25倍,暗示着分子伴侣ORF1-ORF2在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量。4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)形成的Cry11Aa蛋白晶体的形状和大小相似,两者对致倦库蚊的生物活性没有明显差异,LC50s分别为 59.33 ng/mL和66.21 ng/mL,。【结论】推测晶体蛋白Cry11A能否成功表达与其使用启动子的类型和两者的协调配合有关。分子伴侣ORF1-ORF2虽然在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量,但对提高Cry11Aa蛋白的杀蚊毒力没有显著性帮助。

    • 嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析

      2008, 48(5):677-683.

      摘要 (1396) HTML (0) PDF 0.00 Byte (1309) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】嗜线虫致病杆菌是一种昆虫病原线虫共生菌,它能够产生多种杀虫毒素。本研究旨在从嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株的细胞内纯化新的杀虫蛋白毒素,并对其进行基因克隆和序列分析。【方法】应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法纯化蛋白,再通过对5龄大蜡螟幼虫血腔注射进行活性筛选。对获得的目的蛋白与已知蛋白进行同源分析,克隆出该目的蛋白的基因序列,从而进行相应的基因和氨基酸序列分析。【结果】本研究纯化的Tp40蛋白对大蜡螟LD50为68.54 ng/头,其SDS-PAGE电泳图谱只显示出一条分子量约为42 kDa的多肽。Western印迹分析表明Tp40与已知的Txp40为同源蛋白,并且仅存在于细胞内。编码该蛋白的基因开放读码框全长1107bp (GenBank 登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5 kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%~99%和70%~99%。【结论】Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性,是昆虫病原线虫共生菌复合体杀虫过程中的一种关键因子。

    • 苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

      2008, 48(5):684-689.

      摘要 (1202) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2327) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究。【方法】本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力。【结果】经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12。重组表达质粒pET-2Aa在E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 mg/mL和22.3 mg/mL。【结论】菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义。

    • 苏云金芽孢杆菌Bt9875晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡

      2008, 48(5):690-694.

      摘要 (1286) HTML (0) PDF 0.00 Byte (2754) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)Bt9875菌株晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响。【方法】采用MTT比色、荧光显微观察、DNA凝胶电泳、流式细胞术等方法来检测不同浓度的Bt9875晶体蛋白处理后HL-60细胞的凋亡特征。【结果】Bt9875晶体蛋白对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100 mg/mL晶体蛋白作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。【结论】初步证明了Bt9875晶体蛋白在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导其凋亡,这为苏云金芽抱杆菌晶体蛋白的应用开创了新的思路。

    • >学科先贤
    • 极地微生物 —— 新天然药物的潜在来源

      2008, 48(5):695-700.

      摘要 (1617) HTML (0) PDF 0.00 Byte (3314) 评论 (0) 收藏

      摘要:微生物是极地生态系统的重要组成部分。由于极地独特的地理、气候及环境特点,极地微生物所具有的新颖性与多样性,在科学研究、应用开发等方面都具有重要价值,并逐渐受到人们的广泛关注。有关极地微生物的资源勘探与代谢活性产物研究,已成为国际微生物学研究的热点之一。结合笔者的工作实践,对近年来极地微生物资源的勘探与收集情况进行了介绍,并着重对以医药与生物农药等为目标的极地微生物产活性化合物的研究现状进行了概述,同时还对目前一些影响研究工作开展的限制因素进行了讨论。可以预见,针对极地微生物资源的研究开发工作,将会给新型天然药物的筛选与发现带来新的机遇与突破。

    • 促旋酶(gyrase) B亚单位基因gyrB在鉴别细菌近缘种中的应用

      2008, 48(5):701-706.

      摘要 (1970) HTML (0) PDF 0.00 Byte (4790) 评论 (0) 收藏

      摘要:单拷贝的gyrB是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因,该基因进化速率快,每100万年的平均碱基替换率为0.7%~0.8%。研究证明,该区段基因能对假单胞菌、芽孢杆菌、弧菌、肠杆菌、分枝杆菌、气单胞菌、乳酸菌等不同属或科内的近缘种进行区分鉴定,还可通过设计种特异性引物进行定量PCR或者限制性片段分析,同时也能结合变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)追踪微生物的动态。gyrB基因弥补了非蛋白编码基因16S rDNA或者基因间隔序列(ITS)DNA无法区分近缘种的缺陷,给近缘种的鉴别或者其群体指纹图谱的分析带来了新的希望,为当前国内外用于近缘种研究的热点,是细菌系统发育分析上非常值得重视的新靶标。

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