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微生物学报

  • 2005年第45卷第1期文章目次
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    • 太平洋帕里西维拉海盆细菌多样性的非培养的初步分析

      2005, 45(1).

      摘要 (591) HTML (0) PDF 232.84 K (2240) 评论 (0) 收藏

      摘要:从环境中直接提取总DNA,构建了含32个有效转化子的太平洋帕里西维拉(Parece Vela)海盆5010米深处底泥的细菌16S rRNA基因文库。测序结果表明,可以将32条有效序列分为17个不同的分类单元。大部分序列与已知细菌类群的16S rDNA序列相似性较高,归属于Proteobacteria的gamma亚群、alpha亚群和海洋非培养细菌类群,主要分布在Pseudoalteromonas属、Halomonas属、Alcanivorax属、Photobacterium属、Acinetobacter属;部分序列与已知细菌类群的16SrDNA序列同源性较低,可能代表新的分类单位。研究结果表明,帕里西维拉海盆不仅含有丰富的微生物物种,并且存在尚未被认识的新物种。

    • 一株烟酸羟基化转化菌株的筛选和鉴定

      2005, 45(1).

      摘要 (871) HTML (0) PDF 193.77 K (1646) 评论 (0) 收藏

      摘要:从南京地区的土壤中筛选到一株高效转化烟酸为6_羟基烟酸的菌株NA_1。形态及生理生化特征测定结果表明,NA_1菌株与假单胞菌属(Pseudomonas)中的恶臭假单胞菌(P. putida)种的特征基本一致。测定了该菌株的16S rDNA序列并根据16S rDNA构建了系统发育树;在系统发育树中,NA_1菌株与恶臭假单胞菌形成一个类群,序列同源性为99%。因此将NA_1菌株鉴定为恶臭假单胞菌。

    • 圈卷产色链霉菌分化相关基因samR调控的初步研究

      2005, 45(1).

      摘要 (1157) HTML (0) PDF 270.68 K (1681) 评论 (0) 收藏

      摘要:在野生型的圈卷产色链霉菌中,增加单个或多个拷贝数的samR,观察该基因对野生株表型和形态的影响。结果表明,samR的拷贝数的增加会使孢子形成提前,但是增加单拷贝的菌株与增加多拷贝的菌株所表现的增效作用相同。在大肠杆菌中对samR进行了GST融合表达和纯化,通过凝胶阻滞实验证明,SamR蛋白可与其上游的调控区特异性结合。由此推测samR是一个自调控基因。

    • 铜绿假单胞菌色素代谢相关基因的研究

      2005, 45(1).

      摘要 (529) HTML (0) PDF 222.79 K (1930) 评论 (0) 收藏

      摘要:首次应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌色素合成与调控的机制。通过一系列的表型筛选,得到8株色素合成能力改变的突变子。经基因克隆、核苷酸测序研究,证明转座子分别插入到hmgA、ptsP、sucC、phzS、phzF1五个基因中。hmgA基因转座失活导致酪氨酸分解代谢中间产物尿黑酸的积累,后四种情况转座突变显著地影响了铜绿假单胞菌最重要的色素绿脓素(pyocyanin)的合成,其中PhzS和phzF1是绿脓素合成过程中的结构基因,ptsP基因是1个磷酸转移酶系统的重要组分,sucC基因的产物是三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A合成酶,对后两个基因在色素合成的调控方面可能起到重要作用的报道尚属首例。

    • 华癸根瘤菌中自体诱导物的初步研究

      2005, 45(1).

      摘要 (970) HTML (0) PDF 258.44 K (2054) 评论 (0) 收藏

      摘要:群体感应(Quorum sensing)是细菌通过产生可扩散的小分子量自体诱导物信号分子感知细胞群体密度变化,进行基因表达调控的生理行为。将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)构建为超量表达群体感应调节蛋白TraR的检测菌株JZA1,试验证明该检测菌株能检测纳摩尔浓度的自体诱导物,利用该菌株对3株不同华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)进行自体诱导物活性检测,发现该3株华癸根瘤菌均能产生自体诱导物,其表达量与菌体密度成正相关,但3株菌在相同培养条件下自体诱导物的表达量存在差异,结果表明自体诱导物在种内水平上存在一定的多样性;同时发现高pH条件能大大降低自体诱导物的稳定性,为进一步研究群体感应调节在共生固氮上的作用提供理论及实践依据。

    • 渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响

      2005, 45(1).

      摘要 (882) HTML (0) PDF 240.65 K (1670) 评论 (0) 收藏

      摘要:枯草芽孢杆菌93151的渗透压调节基因proB和proA以重叠基因的方式组织,但是表达两个单独的蛋白质ProB和ProA。通过引物设计,在抗脯氨酸反馈抑制耐盐突变菌株9315114的proBA基因重叠区引入一个限制性酶切位点,分别扩增出proB和proA基因,并构建融合的proBA基因。SDSPAGE分析显示有一条新的分子质量约为85kD的蛋白带出现。相对于表达未融合的proB和proA,proBA融合基因的表达明显提高了宿主菌大肠杆菌JM83胞内游离脯氨酸含量和其耐高渗胁迫能力。

    • 通过特异PCR扩增和16S rDNA序列分析检测动弯杆菌

      2005, 45(1).

      摘要 (421) HTML (0) PDF 284.49 K (2598) 评论 (0) 收藏

      摘要:细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis,BV)是由于细菌过度生长所致阴道微生态非正常改变,从而导致的一类多微生物病(Polymicrobial Diseases)。动弯杆菌(Mobiluncus sp.)与BV发生有密切关系,但该菌为厌氧菌,营养要求苛刻,很难进行纯培养,国内鲜有研究报道。本文先对BV动物模型恒河猴阴道分泌物进行厌氧菌混合培养,抽提混合物染色体DNA,之后设计了一对动弯杆菌16S rRNA基因的特异性引物,用PCR的方法扩增出了特异片段。通过对扩增产物进行测序分析,确定检测出的为动弯杆菌,并且与羞怯动弯杆菌极为相似。

    • 幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用

      2005, 45(1).

      摘要 (569) HTML (0) PDF 158.88 K (1546) 评论 (0) 收藏

      摘要:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ureB基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用。用PCR方法从Hp标准株NCTC11637中获取ureB全长基因,将其开放读码框架定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1;获得的重组子转染SGC7901细胞,筛选耐潮霉素的细胞克隆,用RTPCR方法检测细胞内ureB基因在转录水平的表达;分别用荧光染色技术、MTT、流式细胞术检测UreB对细胞表型、增殖、凋亡及细胞周期的影响。UreB阳性表达的细胞(SureB)胞膜出芽、细胞皱缩;用MTT法检测细胞增殖,结果表明,SureB细胞与SpcDNA31细胞比较(pcDNA3.1转染的细胞),生长增殖无显著性差异(P>0.05),流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,SureB的凋亡率显著高于SpcDNA3.1(P值为0.007);细胞周期分析显示,SureB细胞有S期比率增高、G-2-M、G-0-G1期比率下降的趋势。ureB在培养细胞内的表达可促进细胞凋亡。

    • 一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达

      2005, 45(1).

      摘要 (526) HTML (0) PDF 270.35 K (2043) 评论 (0) 收藏

      摘要:利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4Kan序列片段,与pPICZα重组,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4Kan序列,能整合到酵母染色体上,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(357bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式,分别构建含有1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体,电击法转化毕赤酵母GS115菌株,用G418和Zeocin筛选转化子,筛选到的阳性转化子用05%甲醇诱导,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒,ELISA和Western blot检测表明:表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性。

    • 抗冷冻蛋白基因遗传转化草菇的研究

      2005, 45(1).

      摘要 (846) HTML (0) PDF 271.01 K (1918) 评论 (0) 收藏

      摘要:采用RT-PCR技术从瑞典的北极云杉卷叶蛾幼虫中扩增出抗冷冻蛋白基因,利用基因枪法遗传转化草菇。PCR检测和Southern杂交结果证明,抗冷冻蛋白基因已整合进草菇基因组。低温胁迫试验结果表明,转基因草菇具有较强的耐低温能力。转基因草菇生物学特性观测结果显示,大多数草菇转化子的生长速率明显地慢于对照的宿主菌株,多数转化子的菌丝也明显地比宿主菌丝细弱。转化子筛选结果表明,采用三轮的转化子筛选程序,即第一轮在固体培养基上筛选、第二轮和第三轮在液体培养基中筛选,有利于获得真实转化子和淘汰假转化子。转基因草菇一代低温胁迫结果证明,转基因草菇后代仍然具有较强的低温耐受能力,这说明转基因草菇的耐低温性能在世代之间是稳定的。

    • 富集液中六六六(γ-BHC)脱氯基因的克隆、表达及降解试验

      2005, 45(1).

      摘要 (875) HTML (0) PDF 254.82 K (1339) 评论 (0) 收藏

      摘要:从长期受六六六污染的土壤中获得高效降解六六六的富集液,其对六六六4种异构体的降解效果均为100%,但至今未能获得纯培养。根据国外报道的六六六脱氯基因linA序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术从富集液总DNA中扩增了471bp的基因片段,命名为linN,测序结果表明linN与报道的脱氯基因linA和linA2的同源性达99%,与linA1的同源性达97%。将linN定向克隆到pET29α表达载体中,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约17kD的蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%左右;诱导后转化子的降解能力明显提高,粗酶也有很好的降解效果,为进一步分离纯培养和构建多功能农药残留降解菌提供了基础。

    • 广东番茄曲叶病毒G2分离物基因组DNA-A的分子特征

      2005, 45(1).

      摘要 (489) HTML (0) PDF 228.55 K (1568) 评论 (0) 收藏

      摘要:从采集于广东的番茄曲叶病病株上分离到病毒分离物G2,序列分析结果表明,其DNA_A为单链环状,全长2744nt,共有6个ORF,其中病毒链上编码AV1(CP)、AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。BLAST结果显示,与G2基因组有同源关系的病毒均属双生病毒科菜豆金色花叶病毒属。序列比较结果显示,G2与菜豆金色花叶病毒属病毒的DNA_A序列同源率均不超过83%,其中同源率最高的是PaLCuCNV_[G10](82.8%)。进一步比较发现,它们的基因间隔区(IR)变异最大(同源率为30.9%~81.8%);CP氨基酸序列的同源率较高(77.6%~99.2%),AC4蛋白氨基酸序列的同源率较低(43.5%~78.8%)。系统进化关系分析结果也显示,G2与已报道的菜豆金色花叶病毒属病毒的亲缘关系均较远。因此,G2可能是双生病毒科菜豆金色花叶病毒属中一个未报道的新种,命名为广东番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangdong Virus, ToLCGDV)。

    • 用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重组流感病毒

      2005, 45(1).

      摘要 (808) HTML (0) PDF 208.75 K (2548) 评论 (0) 收藏

      摘要:选择一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒(AIV),缺失其HA基因裂解序列的4个碱性氨基酸、使HA裂解模式由高致病性的PQRERRRKKR↓GL突变为低致病性的PQRESR↓GL,将修饰的HA基因克隆入转录/表达载体pHW2000、构建质粒pHW524_HA,将该毒株和H9N2亚型毒株的NA全基因分别克隆入pHW2000,构建质粒pHW506_NA和pHW206_NA。将pHW524_HA与pHW506_NA或pHW206_NA组合、均用A/WSN/33(H1N1)提供6个内部基因,两个组合的8个质粒分别共转染COS_1细胞,产生了H5N1和H5N2两个亚型的基因重排病毒。通过在鸡胚中的连续传代和适应,2个重组病毒血凝价上升到1∶29、表面基因稳定、对6周龄SPF鸡不表现致病性,H5N2重组病毒对鸡胚的毒力低于H5N1病毒。这种尝试证明反向遗传操作技术是研究AIV致病性和构建疫苗候选株的有用工具。

    • H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

      2005, 45(1).

      摘要 (913) HTML (0) PDF 233.90 K (2479) 评论 (0) 收藏

      摘要:根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 , 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为:OD待检血清>05,且 OD待检血清/OD阴性血清>2。

    • N端融合外源蛋白的兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究

      2005, 45(1).

      摘要 (434) HTML (0) PDF 303.17 K (1374) 评论 (0) 收藏

      摘要:将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBACHIS2_B的6*HIS表达标签下游,与线性化野生型杆状病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞,经蚀斑纯化后获克隆化重组杆状病毒pBLUEBACHIS2B_VP60。以重组杆状病毒感染Sf9细胞,经SDS_PAGE和Western blot检测显示高效表达一分子量为69kD的重组蛋白,并且该蛋白可被兔抗R HDV高免血清识别。血凝试验表明,该重组蛋白可以凝集人“O”型红细胞,血凝价达216,同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察,重组病毒表达的融合有6*HIS表达标签的衣壳蛋白仍可在昆虫细胞内自聚成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上相似的病毒样颗粒(VLPs),并且该VLPs与兔抗RHDV高免血清作用后于电镜下可见凝集成团的现象,表明其与天然RHDV病毒粒子在抗原性上也极为相似。

    • 猪瘟病毒糖蛋白Erns中和表位的鉴定和比较

      2005, 45(1).

      摘要 (813) HTML (0) PDF 342.68 K (2326) 评论 (0) 收藏

      摘要:猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白Erns(gp48)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导CSFV感染细胞的过程。Erns具有RNA酶活性,影响病毒自身复制并涉及对病毒的中和效应。采用抗CSFV alfort Tübingen 毒 株Erns糖蛋白的1B5, b4_22 和24/16单克隆中和抗体,筛选噬菌体展示的12肽随机肽库,进行Erns中和表位的鉴定和比较,获得分别针对1B5、b4_22 和24/16单克隆抗体的3个主要中和表(拟)位基序WxNxxP、DKNR (Q) G和 A(T)CxYxKN,分别定位于Erns的351位~356位或348位~350位、384位~386及322位~323位、380位~386位氨基酸区域。分析表(拟)位基序与单克隆抗体的免疫反应性差异。B4_22 和 24/16单克隆抗体识别基序存在共有序列KN, 识别Erns中的相似抗原区,但其侧翼序列及免疫印迹、免疫荧光抗体抑制试验结果均存在显著差异。

    • 鹅源新城疫病毒ZJ1株微型基因组的构建及其初步应用

      2005, 45(1).

      摘要 (720) HTML (0) PDF 282.16 K (1375) 评论 (0) 收藏

      摘要:在获得鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列的基础上,用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因取代鹅源新城疫病毒ZJ1株整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒粒子包装相关的调控序列,将其反向克隆入转录载体TVT7R(0.0)中,构建了该毒株的微型基因组。当转染用辅助病毒ZJ1株感染的Hep_2细胞时报告基因得到表达,表明此微型 基因组RNA可被辅助病毒提供的NP、P和L蛋白翻译。同时将该病毒NP、P和L蛋白基因分别克隆入真核表达载体pCI_neo中,构建了表达该病毒NP、P与L蛋白的辅助质粒,用此微型基因组对辅助质粒的表达产物进行了功能鉴定并对该病毒拯救过程中痘苗病毒的最适感染剂量进行了摸索。以上研究为该病毒的成功拯救及开展其它相关研究奠定了基础。

    • 一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略

      2005, 45(1).

      摘要 (856) HTML (0) PDF 203.44 K (2159) 评论 (0) 收藏

      摘要:为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平,在途径分析的基础上提出了一种组成型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得1株乙酸需求型突变株CCTCC M202019,在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株21%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCC M202019中丙酮酸代谢相关酶的活性发现:(1)丙酮酸脱羧酶活性降低了40%;(2)外加乙酸与否的条件下,乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了103.5%和57.4%;(3)添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。在含有乙酸的培养基中突变株细胞干重比出 发株高21.7%,可能是因为乙酰辅酶A合成酶活性的提高,补充了因丙酮酸脱羧酶活性降低而引起的胞质乙酰辅酶A短缺。在7L罐中含有6g/L乙酸钠的培养基中发酵62h,丙酮酸产量达到68.7g/L,对葡萄糖的产率为0.651g/g。

    • Mn2+对必特螺旋霉素产生菌代谢和必特螺旋霉素合成的影响

      2005, 45(1).

      摘要 (483) HTML (0) PDF 216.06 K (1431) 评论 (0) 收藏

      摘要:通过在必特螺旋霉素产生菌WSJ1195发酵过程中添加金属离子Mn2+发现:发酵前期(24h左右)添加Mn2+可以明显提高生物效价,加入的Mn2+浓度以5mmol/L为最佳。实验显示添加Mn2+后发酵液pH逐渐下降,整个产素期间 pH一直低于对照;与对照相比添加Mn2+摇瓶菌体浓度也较低。通过研究必特螺旋霉素发酵过程有机酸的变化趋势发现:24h添加5mmol/L Mn2+后发酵过程中有机酸含量已经发生变化,其中丙酸浓度的增长最为显著,84h时其浓度为对照的6倍。通过丙酸盐的添加实验证实了发酵前期添加Mn2+可以促进产物合成的原因之一是促进了丙酸等前体酸的合成,丰富了大环内酯合成的前体库。

    • 绿脓菌素激活MAPKs、NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL8表达

      2005, 45(1).

      摘要 (763) HTML (0) PDF 232.36 K (1662) 评论 (0) 收藏

      摘要:采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株 A549 和 SPCA1,用ELISA方法检测细胞 IL8分泌水平,并使用免疫印迹(Western blot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NFκB及丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)的激活作用。实验发现,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株 IL8 分泌增加,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内 IκBα-发生降解,同时使MAPK家族蛋白分子(ERK1/2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1/2(ERK1/2激酶)抑制剂 U0126(10μmol/L)和 p38 MAPK 抑制剂 SB203580(10μmol/L)可降低绿脓菌素诱导 A549 细胞 IL8 的合成。以上结果显示绿脓菌素通过 MAPK 信号传导通路增强呼吸道上皮细胞 IL8 的表达;NFκB 通路也参与了绿脓菌素调控细胞 IL8 表达的过程。

    • 产木聚糖酶的沿海红树林真菌筛选及其培养与酶活测定条件优化

      2005, 45(1).

      摘要 (652) HTML (0) PDF 274.42 K (2215) 评论 (0) 收藏

      摘要:从香港海岸红树林分离到的77株真菌中有34株可产生木聚糖酶,从中选出CY2809 (Staganospora sp.)、CY4786和CY5040等3菌株与已知陆生产酶菌株HU5048(Aspergillus awamori)进行产木聚糖酶的比较研究。根据培养液中菌丝生物量、木聚糖酶活力和木糖等价还原糖含量等指标的测定,菌株CY4786在起始pH 7.8的木聚糖酵母膏海盐液体培养基中25℃下震荡100r/min)培养7d产酶最佳;粗酶液在50℃和pH 46的优化条件下进行测定,木聚糖酶活力达到1.07×10.4U/mL。结果表明,红树林真菌起着半纤维素降解者的作用,沿海红树林环境中存在着可资利用的木聚糖酶产生菌。作者讨论了利用发酵液中木糖等价还原糖含量的动态变化作为快速筛选产木聚糖酶菌株的指标的可能性。

    • 产木聚糖酶的沿海红树林真菌筛选及其培养与酶活测定条件优化

      2005, 45(1).

      摘要 (771) HTML (0) PDF 221.94 K (2110) 评论 (0) 收藏

      摘要:从香港海岸红树林分离到的77株真菌中有34株可产生木聚糖酶,从中选出CY2809 (Staganospora sp.)、CY4786和CY5040等3菌株与已知陆生产酶菌株HU5048(Aspergillus awamori)进行产木聚糖酶的比较研究。根据培养液中菌丝生物量、木聚糖酶活力和木糖等价还原糖含量等指标的测定,菌株CY4786在起始pH 7.8的木聚糖酵母膏海盐液体培养基中25℃下震荡100r/min)培养7d产酶最佳;粗酶液在50℃和pH 46的优化条件下进行测定,木聚糖酶活力达到1.07×10.4U/mL。结果表明,红树林真菌起着半纤维素降解者的作用,沿海红树林环境中存在着可资利用的木聚糖酶产生菌。作者讨论了利用发酵液中木糖等价还原糖含量的动态变化作为快速筛选产木聚糖酶菌株的指标的可能性。

    • 肉毒碱乙酰转移酶基因敲除对长链二元酸生产代谢过程的影响

      2005, 45(1).

      摘要 (1045) HTML (0) PDF 183.93 K (1912) 评论 (0) 收藏

      摘要:在利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的过程中,脂肪酸将进入β-氧化途径,代谢产生能量,从而降低产物收率。首次以负责运输的肉毒碱乙酰转移酶为改造目标,在肉毒碱乙酰转移酶基因中插入潮霉素B抗性基因,构建DNA转化质粒,并进行一次同源重组,得到肉毒碱乙酰转移酶基因单拷贝敲除的基因工程菌。根据摇瓶实验结果,该基因工程菌与原始菌株相比,十三碳二元酸的产量与摩尔转化率分别提高了13.0%和11.8%。

    • 含水量与温度对球孢白僵菌孢子粉贮存寿命的影响及模拟分析

      2005, 45(1).

      摘要 (498) HTML (0) PDF 250.56 K (1321) 评论 (0) 收藏

      摘要:将含水量1.12%、4.73%、7.23%、9.84%及14.11%的球孢白僵菌Beauveria bassiana SG8702分生孢子粉在4℃和25℃下黑暗贮存18个月,定期检测活孢率,以确定孢子粉的贮存寿命结果显示,各温度处理中含水量显著(P<0.05)影响孢子贮存期间的活孢率。在4℃下,含水量为1.12%~9.84%处理的活孢率在头16个月均稳定在91%以上,且相互间差异不显著;次高含水量处理的活孢率在第18个月才显著低于其它较低含水量处理;高含水量处理的活孢率则从第6个月起显著低于其余较低含水量处理,第12个月时降至24.2%。而在25℃下,第3和第6个月的活孢率在不同含水量处理间均呈极显著差异(P<0.01),即随含水量升高而显著下降,次高含水量处理在第6个月的活孢率仅剩17.6%。贮存期间活孢率对贮存时间和孢子粉含水量的依赖关系很符合改进的存活衰变模型(r2>0.85)。根据拟合的模型预测,在4℃下贮存,若保证活孢率90%,12%含水量的孢子粉可贮存73个月,10%为112个月,9%为14.9个月,8%为21.0个月,7%为33.0个月,6%达65.5个月,故孢子粉冷贮的含水量应控制在8%以下。若在25℃下贮存并保证活孢率80%,含水量10%的孢子粉仅可贮存1.7个月,8%为2.3个月,6%为3.0个月,4%为3.8个月。显然,孢子粉常温贮存必须将含水量控制在5%以下,才能贮存3个月以上并使活孢率预期达到80%。

    • 衣壳蛋白靶向灭活策略应用于抗登革病毒感染的研究

      2005, 45(1).

      摘要 (1048) HTML (0) PDF 257.79 K (1697) 评论 (0) 收藏

      摘要:衣壳蛋白靶向病毒灭活是近年来新兴的抗病毒策略。为探索该策略在抗登革病毒感染中的应用,首先建立了稳定表达登革2型病毒衣壳蛋白(D2C)与葡萄球菌核酸酶(SN)融合蛋白D2C_SN的哺乳动物细胞系,然后以登革病毒攻击上述细胞系,研究表达的融合蛋白D2C_SN对产生的子代病毒颗粒感染性的影响。结果表明融合蛋白D2C_SN能够在病毒装配过程中与野生型衣壳蛋白共组装入子代病毒颗粒内部,并导致病毒基因组的降解。与正常BHK细胞相比较,融合蛋白D2C_SN可导致产生的子代病毒感染性滴度降低10.3~104,显示出很强的抗病毒效果

    • 栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒单克隆抗体的制备及ELISA检测

      2005, 45(1).

      摘要 (495) HTML (0) PDF 593.52 K (877) 评论 (0) 收藏

      摘要:利用蔗糖密度梯度离心技术从自然发病的栉孔扇贝 (Chlamys farrreri) 组织分离纯化急性病毒性坏死症(Acute virus necrobiotic disease, AVND) 病毒,并以此为抗原免疫Balb/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与NS_1骨髓瘤细胞进行融合,最终筛选出4株能稳定传代并分泌该病毒特异性单克隆抗体(Monoclonal Antibody Mab)的杂交瘤细胞系。应用胶体金标记免疫电镜技术在超微水平上对这4株 Mabs进行测定表明,它们对AVND病毒均具有高度的特异性,并且所识别的特异性位点均位于病毒粒子囊膜的纤突上。应用该单克隆抗体对不同养殖季节的一龄贝进行间接ELISA 检测发现,7月中旬至7月底病毒感染率与感染强度均处于当年的最高峰,与这一时期栉孔扇贝所表现出的最高死亡率完全吻合。

    • 海绵Pachychalina sp.体内古菌多样性非培养技术分析

      2005, 45(1).

      摘要 (761) HTML (0) PDF 291.54 K (1791) 评论 (0) 收藏

      摘要:采用非分离培养分析方法,即16S rDNA限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的古菌多样性进行了研究。从海绵体内直接提取古菌总DNA。以样品总DNA为模板,用古菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增获得16S rDNA,回收、纯化16S rDNA产物并克隆到TVector。进行第二次PCR扩增反应,且对扩增产物进行ARDRA。在古菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱上存在差异;随机挑选8个克隆子进行测序,获得古菌16S rDNA的部分序列,并对16S rDNA序列进行聚类分析构建了系统进化树,结果发现海绵体内的古菌主要属于Methanogenium organophilum、Methanoplanus petrolearius等古菌类。但它们与目前数据库中收录的古细菌间的相似性均不超过90%,它们极有可能是一些新的古菌。

    • 利用不相容质粒共转化大肠杆菌对Cre重组酶体内重组活性的可视检测

      2005, 45(1).

      摘要 (1181) HTML (0) PDF 240.62 K (3273) 评论 (0) 收藏

      摘要:源自噬菌体P1的Cre重组酶可以识别34bp的靶DNA序列loxP,进行位点特异性的重组反应。为了简便地检测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性,分别将cre基因和上下游带有loxP的绿色荧光蛋白基因(gfp)克隆到具有不同抗性的两种不相容质粒中,然后将构建的原核表达载体pET30aCre和pET23bloxGFP电击共转化大肠杆菌L21(DE3),利用卡那霉素和氨苄青霉素双抗生素抗性进行筛选。通过直接观察转化子的绿色荧光,便可以显示Cre酶的体内重组活性,并进一步通过SDSPAGE分析、质粒酶切鉴定进行了验证。结果表明:以gfp为报告基因、通过两种不相容质粒共转化大肠杆菌可以为研究和改进Cre/loxP重组系统提供一种简便直观的检测方法。

    • 根癌农杆菌介导的球毛壳菌遗传转化及T-DNA插入突变体的获得

      2005, 45(1).

      摘要 (609) HTML (0) PDF 216.28 K (1884) 评论 (0) 收藏

      摘要:根癌农杆菌介导的遗传转化系统是植物基因工程常用方法,目前已将这一转化系统应用到酵母、丝状真菌以及人类细胞的转化。利用这一转化系统,成功地实现了丝状真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)的遗传转化,转化率约为60~180个转化子/10.7个孢子 。通过对转化子的PCR检测和Southern 杂交分析表明,TDNA已整合进毛壳菌基因组中,而且在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,转化子都能够稳定遗传。根癌农杆菌介导的遗传转化具有转化率高、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点,因此有可能成为丝状真菌遗传转化和功能基因组研究的有力工具。

    • 侵染节瓜的小西葫芦黄花叶病毒CP基因的克隆、表达及其抗血清的制备

      2005, 45(1).

      摘要 (921) HTML (0) PDF 208.66 K (1503) 评论 (0) 收藏

      摘要:通过鉴别寄主反应、病毒部分序列测定确定了采自广州白云区表现花叶、斑驳症状的节瓜上的病毒为ZYMV。采用RTPCR方法扩增和克隆了该病毒的外壳蛋白基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上。获得的重组子pETZCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Western blot分析表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为33.0kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清。ELISA测定其效价为1/4096。

    • 黑曲霉木聚糖酶在工业酒精酵母中的分泌表达

      2005, 45(1).

      摘要 (793) HTML (0) PDF 225.33 K (1156) 评论 (0) 收藏

      摘要:用重叠延伸PCR方法从黑曲霉(Aspergillus nige)UV11的基因组DNA中克隆出木聚糖酶的cDNA基因,构建了由酵母乙醇脱氢酶(ADH1)启动子和终止子引导表达、木聚糖酶自身信号肽引导分泌、rDNA序列介导的酵母整合型分泌表达质粒pAX2。用pAX2与酵母Yep型G418抗性质粒共转化野生型工业酒精酵母S.cerevisiae 2346,获得了整合型分泌表达木聚糖酶的酵母重组菌株XY2。发酵分析表明该工程菌能够明显提高酒精生产率。

    • 山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

      2005, 45(1).

      摘要 (782) HTML (0) PDF 181.38 K (2417) 评论 (0) 收藏

      摘要:以质粒pKF3为模板,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,连至pMD18T载体,构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh,与pMD18PC连接,得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切,回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段,电转化至JM109/pKD46,在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组,将基因ptsG敲除,替换为catsdh基因,获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物,JM109s基因组DNA为模板进行PCR,扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。

    • 适冷海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)MB-1内切葡聚糖酶基因的克隆和表达

      2005, 45(1).

      摘要 (1060) HTML (0) PDF 205.75 K (2279) 评论 (0) 收藏

      摘要:从黄海深海海底淤泥中筛选出一株产纤维素酶的适冷革兰氏阴性杆菌MB1,克隆和分析了MB1的16S rDNA序列(GenBank接受号:AY551321),经鉴定为交替假单胞菌(Pseudoalt eromonas),命名为Pseudoalteromonas sp.MB1。克隆了该菌适冷内切葡聚糖酶基因celA(GenBank接受号:AY551322),并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行了表达。重组E.coli菌体破碎后,获取上清液,其中融合蛋白GSTCelA浓度约为78.5mg/L。分析了融合酶GSTCelA的性质,其最适反应温度为35℃,最适反应pH值为72,为中性适冷酶。实验结果为交替假单胞菌低温纤维素酶的基础理论和应用研究奠定了基础。

    • 瘤胃甲烷菌及甲烷生成的调控

      2005, 45(1).

      摘要 (1350) HTML (0) PDF 275.03 K (3747) 评论 (0) 收藏

      摘要:甲烷菌属于古细菌,参与有机物的厌氧降解,生成甲烷。反刍动物瘤胃内甲烷的生成损耗2%~12%的饲料能量,并且通过嗳气排入大气。甲烷不仅是温室气体之一,而且还会破坏大气臭氧层。每年全球反刍动物排放大量的甲烷,减少瘤胃内甲烷的生成对提高饲料能量利用率和改善环境具有重要意义。近年来,有关瘤胃甲烷菌及甲烷生成调控的报道日益增多。概述甲烷菌的特性以及瘤胃内甲烷生成的途径,综述甲烷生成的调控手段,主要包括去原虫、日粮配合、添加电子受体、增加乙酸生成菌等方法。

    • 炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

      2005, 45(1).

      摘要 (1000) HTML (0) PDF 184.18 K (1286) 评论 (0) 收藏

      摘要:炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现,如保护性抗原(PA)的抗体在体内可杀死芽胞;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体;抗多聚谷氨酸(γDPGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用,从而杀死繁殖体;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单、具更高保护率的疫苗奠定了基础。

    • 产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展

      2005, 45(1).

      摘要 (1557) HTML (0) PDF 182.49 K (8048) 评论 (0) 收藏

      摘要:自然界中少量微生物在适宜条件下产生并贮存质量超过其细胞干重20%的油脂,具有这种表型的菌种称为产油微生物。产油微生物利用可再生资源,得到的微生物油脂与植物油脂具有相似的脂肪酸组成,有的还含有丰富的多不饱和脂肪酸,具有广阔开发应用前景。简要介绍了产油微生物的种类和代谢特点,较详细地阐述了微生物产油机制和代谢调控途径的最新研究进展,并对微生物油脂研究的未来发展方向提出了初步见解。

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