Naiqin Zhong, E-mail:
我国盐碱土面积约9913万hm2,其中pH值高于9、盐含量大于0.6%的重度盐碱地每年以1.4%的速率增长。利用固氮微生物改善植物根际环境,提高作物产量,是盐碱地改良的重要方法。
从来自海南省三沙市热带珊瑚岛礁的土壤中,分离鉴定自生固氮菌,为极端盐碱地改良提供候选菌株。
通过形态学观察、生理生化特征分析和16S rRNA序列测定等方法进行菌种鉴定,分析其固氮、耐盐碱和促生长特性,盆栽试验验证其对玉米主要农艺性状的影响。
获得1株极端耐盐碱的固氮细菌DJ-1,其菌落呈圆形,菌体杆状,大小(0.5-1.3)μm×(0.3-0.5)μm,革兰氏染色阴性,与根癌土壤杆菌(
菌株DJ-1能耐受极端盐碱条件,且具有较强的固氮和促生长能力,有可能作为贫瘠盐碱耕地改良功能菌剂的候选菌株。
In China, the saline-alkali soil covers an area of approximately 99.13 million hm2, of which the severe saline-alkali soil with pH value above 9 and salinity greater than 0.6% represents a growth rate of 1.4% per year. Improving plant rhizosphere environment by utilization of nitrogen-fixing microorganisms to increase crop yield is an important method for saline-alkali soil amelioration.
Candidate strains were selected for the amelioration of extreme saline-alkali soils by isolating the autogenous azotobacter from the soil sample collected from the coral reefs in Sansha City, Hainan Province.
The strains were identified through morphological observation, physiological and biochemical characteristics analysis and 16S rRNA sequencing, followed by the analysis of their nitrogen-fixing, salt-tolerant and growth-promoting characteristics, and verification of their effects on the main agronomic traits of corn.
One strain of extremely salt-tolerant nitrogen-fixing bacteria named DJ-1 was obtained. The colony of the strain is round in shape, The individual bacterium is rod-shaped, sizing (0.3-0.5) μm×(0.5-1.3) μm. Negative in Gram Staining, the strain is highly homologous with the 16S rRNA sequence of
The strain DJ-1 has the tolerance to extreme saline-alkali conditions, coupled with high nitrogen fixation and growth-promoting capabilities. It may be a potential candidate strain of functional bacteria for poor saline-alkali farmland amelioration.
氮素是植物生长过程中最关键的营养元素,是氨基酸、蛋白质的重要组成成分。土壤中可利用的氮素十分有限,不能最大限度满足作物的高产需求[
在农业生态系统中,作物生物量中约24%的氮素来自非共生N2O固定[
本文从海南省三沙市热带珊瑚岛极端盐碱土壤中筛选到1株自生固氮菌,通过形态特征、生理生化指标测定及16S rRNA片段(基因)序列分析进行菌种鉴定,研究其环境适应性,并通过盆栽试验验证其固氮和促生长效果,以期为开发极端盐碱地改良复合菌剂提供菌种资源。
海南省三沙市热带珊瑚岛,土样理化性质:pH为9.7,有机碳含量2.45 g/kg,全氮含量0.13 g/kg,全磷含量68.4 mg/kg,速效磷含量14.64 mg/kg,钾含量58.02 g/kg,电导率166 μs/cm,有机质含量0.4%。
蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,用ddH2O定容,调pH至7.0–7.2。
KH2PO4 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,CaCO35.0 g,甘露醇10 g,CaSO4·2H2O 0.1 g,用ddH2O定容,调pH至7.0–7.5。
甘露醇20 g,KH2PO4 0.2 g,K2HPO4 0.8 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaSO4·2H2O 0.1 g,酵母膏0.5 g,FeCl3微量,Na2MoO4·2H2O微量,用ddH2O定容,调pH至7.2。
蛋白胨20 g,K2HPO4 1.725 g,丙三醇15 mL,MgSO4·7H2O 1.5 g,色氨酸0.1 g,用ddH2O定容,调pH至7.2。
将20 mL 0.025 mmol/L的FeCl3缓缓加入30 mL浓硫酸中。
葡萄糖4 g,蛋白胨5 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,用ddH2O定容,调pH至7.0。
NaH2PO4·2H2O 590.5 mg,Na2HPO4·12H2O 2.427 g,NH4Cl 250 mg,KH2PO4·H2O 75 mg,NaCl 125 mg,用ddH2O定容。
A液:称取铬天青S 60.5 mg,用ddH2O定容至50 mL,然后加入10 mL 1 mmol/L FeCl3 (用10 mmol/L HCl配制);B液:称取72.9 mg六烷基三甲基溴化铵(HDTMA),用ddH2O定容至40 mL;将A液混匀后缓缓沿杯壁加入到B液中。
向1 L MSA基础培养基中依次加入50 mL磷酸缓冲液和50 mL CAS染液,混匀即可。
葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,MnSO4·H2O 30 mg,FeSO4 30 mg,Ca3(PO4)2 5 g,酵母粉0.5 g,琼脂20 g,用ddH2O定容,调pH至7.0。
葡萄糖10 g,钾长石2.5 g,Na2HPO4 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g CaCO3 5 g,CaSO4·7H2O 0.1 g,琼脂20 g,用ddH2O定容,调pH至7.0。
细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;2×T5 Super PCR Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司;细菌理化性质检测试剂条购自北京兰伯瑞生物科技有限公司;固氮酶检测试剂盒购自北京鸿跃创新科技有限公司;氨氮和总氮的测定由北京中科光析化工技术研究所完成。
PCR仪S1000购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司;电泳仪EPS 300和凝胶成像分析仪购自上海天能科技有限公司。采用日立冷场发射扫描电子显微镜SU8010观察菌体形态。
称取5 g土样,加入装有45 mL无菌水的三角瓶中,振荡均匀后静置30 min,用无菌水稀释至1000倍;取100 μL均匀涂布于Ashby固体培养基,37 ℃倒置培养3 d,挑选单菌落进行纯化分离,置于4 ℃冰箱内保存备用。
分别配制pH 7、pH 8、pH 9和pH 10,NaCl含量为0.6%的LB液体培养基,接种所筛选到的细菌,37 ℃、200 r/min培养24 h,测定
形态学观察:将待测菌液均匀涂布于固氮培养基,37 ℃培养24 h,观察菌落形态;利用扫描电子显微镜观察菌体形态及大小。
生理生化特性分析:采用Biolog GENIII鉴定板1030鉴定菌株可利用碳源;梅里埃API 20NE非发酵G-杆菌鉴定试剂盒测待试菌株其他生理生化指标。
分子系统学分析:将菌株单克隆接种至LB培养基中,37 ℃振荡培养24 h后送博迈德生物工程股份有限公司测序。将得到的序列在NCBI网站比对,选取相似度高的菌株以及同一菌群内知名度高的菌株作为参考菌株,应用MEGA 5.0软件构建系统发育树。
取固氮菌单菌落分别接种于100 mL LB和固氮液体培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养,间隔2 h取样,分光光度计测定
接种固氮菌单克隆至液体固氮培养基,37 ℃、200 r/min培养24 h,作为种子菌液备用。分别取5 mL种子菌液,接种于pH为7、8、9、10、11、12的液体固氮培养基,37 ℃、200 r/min培养24 h,测定其
配制pH 9,NaCl浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的液体固氮培养基,按5%的接种量接种上述种子菌液,37 ℃、200 r/min培养24 h,测定其
以固氮菌总DNA为模板,采用巢式PCR进行两轮扩增[
引物序列
Primers
Primers | Sequence (5'→3') |
R=A/G; Y=C/T; S=G/C. | |
PolR | ATSGCCATCATYTCRCCGGA |
PolF | TGCGAYCCSAARGCBGACTC |
PolF-GCb | CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTGCGAYCCSAARGCBGACTC |
将上述反应所得PCR产物进行胶回收,并连接T-载体,热击法转化至大肠杆菌DH10B,挑取单克隆接种于液体LB培养基,过夜培养后送至博迈德生物工程股份有限公司测序。将得到的序列在GenBank中进行比对。
将Ashby固体培养基上获得的单克隆接种于液体无氮培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜,6000 r/min离心10 min,将上清液过滤除菌后加至包被固氮酶(NITS)抗体的微孔中,37 ℃温育30 min,洗涤5次,加入HRP标记的固氮酶抗体,37 ℃温育30 min,洗涤5次,加入TMB底物显色10 min,用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(
将37 ℃、200 r/min振荡培养24 h的固氮菌培养液6000 r/min离心10 min后取上清,用0.22 µm滤膜过滤除菌,并送至北京中科光析化工技术研究所测定其氨氮和总氮含量。
将供试菌株接种于100 mL的King氏液体培养基中,37 ℃、200 r/min培养2 d,将培养液离心取上清,按1:1比例加入比色液,在530 nm波长下测定其吸光度,标准曲线采用3-IAA(3-吲哚乙酸)标准品制作,试验重复3次。
将菌株接种于MSA-CAS液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养2 d。培养液由蓝色变为红色、橙黄色或紫色者均为阳性。
将菌株接种至PKO培养基上,37 ℃培养一段时间后,菌落周围形成透明圈者为阳性。
将菌株接种至解钾培养基上,37 ℃培养一段时间后,菌落周围形成透明圈者为阳性。
购买珊瑚砂和玉米种子(品种:正大12),在日光温室中设置2个处理:CK (浇施200 mL H2O);T (浇施含菌量为1×109 CFU的固氮菌悬浮液),6次重复。每盆(13 cm×13 cm)播种4粒玉米种子,出苗后持续观察其生长状况,测定株高、茎粗、叶绿素含量等农艺性状,60 d后测定玉米植株生物量。
在采自海南省三沙市热带珊瑚岛的珊瑚砂中加入腐殖酸,点播玉米种子。玉米出苗后浇施pH 9、NaCl含量0.6%的碳酸盐缓冲溶液,以模拟极端盐碱环境。培养60 d后测定其主要农艺性状,检测DJ-1的固氮促生效果。
试验数据采用Origin 2018和SPSS 20软件处理,运用MEGA 5.0软件构建系统发育树。
从采自海南省三沙市热带珊瑚岛的土壤样品中分离获得3株固氮菌(
菌株的筛选
Screening of strains. A: isolation of nitrogen-fixing bacteria; B: determination of saline-alkali resistance of azotobacter. Values represents means±SD. Three biological repeats were performed.
形态学观察结果如
菌株形态特征
Strain morphological characteristics. A: colony morphology; B: cell size; C: cell morphology.
试验结果如
生理生化性质分析
Analysis of physiological and biochemical properties
Test items | Results | Test items | Results | |
+: positive; -: negative. | ||||
Nitrate reduction | + | Indole test | – | |
Urease | + | Glucose acidification | – | |
Gelatin hydrolysis | – | Glucose assimilation | + | |
D-mannitol | + | Citric acid | – | |
Oxidase | + | Malic acid | + | |
Maltose | + | Fructose | + | |
L-Arginine | + | L-serine | + | |
L-methyl lactate | – | L-galactose lactone | – | |
pH 6.0 | + | 8% NaCl | + |
固氮菌测序结果比对发现,菌株DJ-1 (NMDCN0000M5F)与
基于16S rRNA片段序列构建的菌株DJ-1系统发育树
Strain DJ-1 phylogenetic tree constructed based on the 16S rRNA fragment sequence. T: standard strain. The numbers at each branch points is the percentage supported by bootstrap; Bar 0.005 at the bottom is the sequence divergence. Those in parentheses are the accession numbers in GenBank.
菌株生长特性
Strain growth characteristics. A: growth curve; B: alkali resistance; C: salt tolerance. The asterisks denote statistically significant differences as determined by Student's
以DJ-1的总DNA为模板,扩增出400 bp和1000 bp左右的2个片段(
经测定,DJ-1菌株在液体无氮培养基中培养24 h后,胞外泌铵量为9.8 mg/L,培养液中总氮含量为0.28%,其固氮酶浓度为424.33 ng/L,表明该菌株有较强的自生固氮能力。
在King氏培养基中振荡培养2 d后,用SalKowski比色法检测发现,DJ-1可产生长素(IAA) 34.5 μg/mL;在MSA-CAS液体培养基中振荡培养2 d后其染色液由蓝色变为橙黄色,表明该菌具有产铁载体的能力。在PKO和解钾培养基上培养一段时间后,其菌体周围产生透明圈,表明其具有一定的溶磷和解钾能力(
DJ-1溶磷和解钾的能力
The ability of DJ-1 to dissolve phosphorus and potassium. A: solubilizing phosphorus; B: dissolving potassium.
盆栽试验结果表明,浇施耐盐碱固氮菌DJ-1,玉米植株长势、主要农艺性状及生物量均明显优于对照(
玉米接种DJ-1后的表型
Phenotype of maize inoculated with DJ-1. A: control; B: DJ-1 treatment.
玉米主要农艺指标
Main agronomic indicators of corn. A: plant height; B: thick stem; C: leaf width; D: SPAD. The asterisks denote statistically significant differences as determined by Student's
生物量的积累是玉米对光能利用效率和环境适应能力的综合表现。
玉米生物量
Corn biomass. A: underground part biomass; B: aboveground biomass. The asterisks denote statistically significant differences as determined by Student 's
岛礁珊瑚砂属极端盐碱环境,若不加改良直接播种玉米,种子发芽率很低。按珊瑚砂: 腐殖酸为3:1的量加入腐殖酸,玉米种子均可出苗。
DJ-1在盐碱条件下的接种效果
DJ-1 inoculation effect under saline-alkali conditions. A: plant height; B: thick stem; C: SPAD. The asterisks denote statistically significant differences as determined by Student's
近20年来,在微生物资源的研究工作中,一个新的热点是植物根际促生细菌,这类细菌存在于植物根圈范围内,在代谢过程中能产生促进植物生长的物质,而根癌土壤杆菌就是其中一个重要的种类。《伯杰细菌鉴定手册》认为这类细菌没有固氮功能,将其列入土壤杆菌属,而非根瘤菌属。至1990年,英国Sastry[
直接氮输入和间接NO3-增加是提高土壤无机氮含量的重要措施,但也能引发钙、镁淋溶和土壤理化性质的改变,使难降解化合物积聚,导致土壤板结、生物多样性和稳定性降低、土壤中磷(P)含量减少等一系列问题[
分离的固氮菌,最适生长pH值范围为7–9[
截至目前,尚未见耐受极端盐碱环境的土壤根癌杆菌报道。张广志等采用原生质体融合技术将耐盐菌与圆褐固氮菌(
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