Jiansong Ju, Tel:+86-311-80787573;Fax:+86-311-80789794;E-mail:
#并列第一作者
#These authors contributed equally to this work
通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。
利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因
经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,
丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。
To enhance the catalytic activity of alanine racemase from
A mutant library of alanine racemase from
Three mutants Y343H, A3VY343H and A3V with improved catalytic activities were obtained by two rounds of error-prone PCR and site-directed mutagenesis, separately. Based on the kinetic parameters, the mutant Y343H only displayed a 2.01 and 3.68-fold improvement in catalytic efficiency (
The residue A3 located at N-terminus of StAlr might be a key residue for its catalytic activity and oligomerization state.
丙氨酸消旋酶(alanine racemase,Alr,EC 5.1.1.1)是以Pyridoxal 5′-phosphate (PLP)为辅酶催化L-丙氨酸和D-丙氨酸旋光性转换的一类异构酶[
丙氨酸消旋酶除了作为抗菌药物筛选的靶标广受关注外,它还是生物合成D-氨基酸的关键酶之一。Galkin等曾提出利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶等共同作用生产D-氨基酸的方法[
当前开展酶分子改造策略主要分为两大类,即理性设计和非理性设计[
本研究通过易错PCR技术,以鼠伤寒沙门氏菌(
大肠杆菌MB2795 (
以表达载体pTrc99A-StAlr为模板进行易错PCR,引物为Rv-M (5′-GAGCGGATAACAATTTC ACACAGG-3′)和Trc-B (5′-TCTGTTTTATCAGA CCGCTTC-3′)。PCR反应程序为:85 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,54 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,50个循环;72 ℃ 2 min。
易错PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化,以限制性内切酶
以第一轮筛选所得最佳突变体为模板,重复上述步骤,进行第二轮易错PCR。
采用电转化法将浓缩质粒DNA转入感受态细胞UT5028中,经SOC培养液预培养后,分别涂布在含Amp和D-丝氨酸(5.0 mmol/L)的M9基础培养基上,37 ℃下培养40 h;将所有克隆子分别培养于含Amp的LB液体培养基中,37 ℃过夜培养后离心收集菌体,提取其质粒DNA;随后通过化学转化法将质粒DNA再次转入UT5028中,经37 ℃过夜培养后,挑取克隆子划线培养于含Amp的M9培养基上,继续培养以剔除其中的假阳性突变体。
将筛选获得的突变体质粒及野生型pTrc99A- StAlr各取3.0 μL,通过化学转化法转入感受态细胞MB2795中,涂布于含Amp的LB固体培养基上,于37 ℃过夜培养;挑取单一克隆子接种于LB+Amp培养液中振荡培养,次日移取培养物100 μL转入5 mL含有Amp和IPTG (0.1 mmol/L)的LB培养液中培养7 h,离心收集菌体。
将菌体重悬于0.5 mL含有10 μmol/L 5′-磷酸吡哆醛(5′-phosphopyridoxal,PLP)和0.01% 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)的磷酸钾缓冲液(50 mmol/L,pH 7.4)中,通过超声破碎法裂解细胞,4 ℃下15000 r/min离心10 min除去细胞碎片,采用Protein Assay Reagent (Bio-Rad)检测裂解液的蛋白浓度。
分析发现,基因
以质粒pTrc99A-StAlr和筛选获得的突变体质粒DNA为模板,正向引物为StalrA2 (5′-
将上述4个表达载体分别转入BL21(DE3)感受态细胞中,于LB培养液(Amp+)中培养至
加入细胞裂解液(50 mmol/L NaH2PO4 pH 8.0,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L Imidazole)悬浮菌体,以超声破碎法裂解菌体,4 ℃、10000 r/min离心10 min,采用Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,以透析法除去咪唑和NaCl,保存于−80 ℃。以12.5% SDS-PAGE检测蛋白表达量及纯度,利用BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce,USA)测定其浓度。
按照文献所述方法依次进行丙氨酸消旋反应和D-氨基酸氧化反应[
采用HPLC测定丙氨酸消旋酶的动力学参数[
取1.3所制备的裂解液上清(丙氨酸消旋酶含量为54 mU、1.4 U和12 U),以凝胶过滤层析法分离蛋白,层析柱为HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (1.6×60 cm,Amersham Biosciences),流动相为含有150 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L EDTA、20 μmol/L PLP和0.01% (
蛋白标准品为Cytochrome C (12.4 kDa),Carbonic anhydrase (29 kDa),Bovine serum albumin (66 kDa),Alcohol dehydrogenase (150 kDa) (Sigma,USA),根据各蛋白在层析柱中洗脱体积绘制标准曲线计算丙氨酸消旋酶StAlr及突变体的分子量。
alrSt的核苷酸序列的GenBank登录号为WP_001147297.1。采用Swiss-Model在线软件构建野生型蛋白StAlr和突变体A3V的三维结构(https://swissmodel.expasy.org/interactive)[
经检测,当M9选择培养基中D-丝氨酸浓度 > 5 mmol/L时,含质粒pTrc99A-StAlr的缺陷菌株UT5028能够顺利生长,而当D-丝氨酸≤5 mmol/L时,菌株不能正常生长,因此,以含5 mmol/LD-丝氨酸的M9培养基作为选择培养基。
将易错PCR产物与载体pTrc99A连接后转入缺陷菌株UT5028,经过培养从含有5 mmol/L D-丝氨酸的M9培养基上获得47个克隆子。提取质粒DNA后,通过化学转化法逐一转入感受态细胞UT5028中,过夜培养后,挑取克隆子划线培养于含5 mmol/L D-丝氨酸的M9培养基上,最终获得7个能够弥补菌株UT5028缺失功能的突变体。
将上述7个质粒逐一转入缺陷菌株MB2795中,所获得的重组子均能在不含D-丙氨酸的LB琼脂培养基上顺利生长,说明重组子能够弥补缺陷菌株缺失的功能。DNA测序发现,所有质粒中目的基因的核苷酸序列完全一致,与野生型基因
将质粒pTrc99A-Y343H作为模板,进行第二轮易错PCR,PCR产物经过连接、转化感受态细胞及培养后,在含有5 mmol/L D-丝氨酸的M9培养基上获得18个克隆子,提取的质粒DNA后经过菌株UT5028及M9培养基的重复筛选,最终获得12个能够弥补UT5028缺失功能的突变体。
序列检测发现,12个质粒所含的目的基因完全一致,其与野生型
丙氨酸消旋酶的氨基酸序列比对图
Amino acid sequence comparison of alanine racemase. Deduced amino acid sequence of mutant was compared to alanine racemase from
为了明确上述双点突变体中各突变位点的具体作用,采用限制内切酶
将质粒pTrc99A-StAlr、pTrc99A-Y343H、pTrc99A-A3V和pTrc99A-A3VY343H分别转入感受态MB2795中,经过诱导、超声破碎、离心获得裂解液上清,根据所测裂解液中的蛋白含量及反应产物含量计算粗酶液的比活力。由
野生型及突变体蛋白的比活力
Racemization of L-alanine and L-serine by wild type and mutants
Substrate | StAlr | Y343H | A3VY343H | A3V |
L-alanine/(units/mg) | 1.59±0.06 | 2.34±0.05 | 52.38±2.12 | 55.39±2.51 |
Ratio | 1.00 | 1.48±0.02 | 33.00±1.92 | 34.80±0.93 |
L-serine/(units/mg) | 0.10±0.00 | 0.13±0.01 | 3.11±0.02 | 2.84±0.02 |
Ratio | 1.00 | 1.33±0.06 | 31.24±0.48 | 28.54±0.49 |
将构建的表达载体pET-StAlr、pET-A3V、pET-Y343H和pET-A3VY343H逐一转入感受态细胞BL21(DE3)中,经过预培养、诱导、菌体收集、超声破碎及离心分离获得裂解液上清,采用镍亲和层析法纯化酶蛋白,并经透析脱盐后,获得目的蛋白StAlr、A3V、Y343H和A3VY343H。经SDS-PAGE (12.5%)检测,4个酶蛋白均在40 kDa附近有一条清晰的条带(
丙氨酸消旋酶及其突变体纯化SDS-PAGE检测图
SDS-PAGE identification for purification of alanine racemases and mutants. Lane 1: A3VY343H; lane 2: A3V; lane 3: StAlr; lane 4: Y343H; M: molecular mass standards.
以不同浓度的L/D-丙氨酸和L/D-丝氨酸为底物,通过HPLC检测各蛋白催化反应后对映异构体的含量,从而计算StAlr和突变体蛋白的动力学参数(
StAlr和突变体的动力学参数
Kinetic parameters of proteins StAlr, Y343H, A3VY343H and A3V
Protein | Substrate | ||||
StAlr | L-Ala | 9.28±0.86 | 7.56±0.90 | 0.82±0.17 | 1.16±0.05 |
D-Ala | 6.13±0.55 | 4.30±0.35 | 0.70±0.12 | ||
L-Ser | 59.07±3.53 | 3.48±0.23 | 0.06±0.01 | 2.74±0.26 | |
D-Ser | 5.62±0.43 | 0.12±0.02 | 0.02±0.00 | ||
Y343H | L-Ala | 98.14±5.42 | 87.92±6.54 | 0.90±0.12 | 1.31±0.08 |
D-Ala | 28.60±2.89 | 19.48±0.62 | 0.68±0.05 | ||
L-Ser | 266.90±16.74 | 31.57±1.81 | 0.12±0.00 | 1.50±0.04 | |
D-Ser | 129.10±8.24 | 10.23±0.90 | 0.08±0.00 | ||
A3VY343H | L-Ala | 99.90±4.69 | 407.25±24.07 | 4.08±0.43 | 1.30±0.05 |
D-Ala | 32.23±2.16 | 101.41±7.73 | 3.15±0.45 | ||
L-Ser | 156.40±8.66 | 99.28±5.13 | 0.63±0.07 | 1.72±0.05 | |
D-Ser | 87.45±4.81 | 32.45±2.55 | 0.37±0.05 | ||
A3V | L-Ala | 0.93±0.08 | 79.72±5.40 | 85.81±1.58 | 1.25±0.01 |
D-Ala | 0.84±0.06 | 57.59±3.07 | 68.33±1.59 | ||
L-Ser | 20.70±1.47 | 5.64±0.38 | 0.27±0.00 | 1.18±0.00 | |
D-Ser | 1.39±0.09 | 0.32±0.02 | 0.23±0.00 |
比较突变体Y343H、A3VY343H和A3V的动力学参数可以发现,第3位点由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)是导致酶蛋白催化活性大幅提升的关键。当以L-丙氨酸为底物时,突变体A3V的
为了分析突变位点对酶蛋白催化活性的影响,取含不同酶量的裂解液上清,利用凝胶过滤色谱法分离、收集各馏分,并检测各馏分中酶蛋白的相对活性,如
细胞裂解液的凝胶过滤色谱图
Gel filtration chromatography analysis of cell lysates. A:
为了进一步分析突变位点的作用机制,以大肠杆菌K12中丙氨酸消旋酶EcAlr (PDB ID:2RJH,与StAlr同源率为91.36%)为模板[
丙氨酸消旋酶StAlr和突变体A3V三维结构模拟图
Molecular structure modeling of StAlr and mutant A3V based on
易错PCR是较早开发的定向进化技术之一,其本质是通过改变PCR条件,增加目标基因扩增的错配率,从而导致其发生突变。易错PCR通常采取如下策略降低其保真性:选用非保真DNA聚合酶、降低退火温度、采取低浓度dNTP或使4种碱基的比例不均衡、提高Mg2+浓度使其超过正常值、加入Mn2+降低聚合酶对模板的特异性、增加反应循环数、采用多轮易错PCR等[
当然,影响定向进化策略效率的因素除了突变技术外,其筛选方法也至为关键。本实验中以营养缺陷菌株UT5028作为筛选菌株,UT5028缺失了
目前,有关丙氨酸消旋酶的研究主要集中于酶蛋白抑制剂的筛选和设计方面,关于酶学特性改造方面的文献还比较少,且大多着眼于酶蛋白抑制剂的设计。Patrick等通过定点突变将来自
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