郝春博,男,内蒙古包头人,副教授,硕士生导师。2006年毕业于中国科学院生态环境研究中心,获博士学位。2009年6-9月在香港大学地球科学系任访问学者。2013年入选北京高等学校“青年英才计划”。2017年11月-2018年12月在美国迈阿密大学微生物学系任访问学者。主要研究方向为极端环境微生物学。主持国际自然科学基金、教育部博士点基金等科研项目20余项;在Environmental Pollution、Extremophiles等杂志上发表学术论文20多篇
Chunbo Hao, Tel:+86-10-82322332, E-mail:
研究安徽某铁矿不同矿山废水库中微生物群落结构特征及其影响因素。
对比分析了该铁矿3个大型废水库的地球化学特征,并用高通量测序技术研究了水体中微生物群落组成,进而用统计学方法解析了环境因子对微生物群落结构的影响。
3个废水库中有2个为酸性,1个为中性,理化性质有明显的差异。近年形成的塌方采场废水库(TF)pH仅为2.55±0.01,Fe浓度高达154.95±0.78 mg/L,SO42-浓度为3374.86±3.81 mg/L;形成于20世纪70年代的排土场废水库(PT)酸性略弱(pH 2.9±0.02),Fe浓度(34.57±4.00 mg/L)与TF相比明显降低,SO42-浓度则高达10398.98±626.70 mg/L;东沙采场废水库(DS)则为中性(pH 7.55),但SO42-仍高达4162.99 mg/L,主要的金属离子为Mg(594.90 mg/L)、Ca(650.10 mg/L)。3个废水库的原核生物多样性随pH的升高而升高。两个酸性废水库的原核生物组成较为接近,但TF的化能自养菌含量较高(69.54%±2.89%),PT的化能异养菌含量较高(64.45%±13.81%)。自养铁氧化菌
To study the prokaryotic and eukaryotic community structure and the physicochemical factors influencing their distribution in three mine wastewater lakes from a pyrite mine in Anhui Province.
Geochemical analysis characteristics of three wastewater lakes were measured, and microbial community compositions of the lakes were studied using high-throughput sequencing. The relationship between microbial community structure and environmental factors was also analyzed based on statistical methods.
Samples from three wastewater lakes included two acidic and one neutral, with significant differences in physicochemical properties. Lake TF, typically acidic, formed about 5 years ago and is characterized by low pH (2.55±0.01), Fe (154.95±0.78 mg/L) and SO42- (3374.86±3.81 mg/L). Lake PT is also acidic, pH (2.9±0.02), however, it formed in the 1970's, and has significantly lower Fe (34.57±4.00 mg/L) and higher SO42- (10398.98±626.70 mg/L) than lake TF. Lake DS is neutral (freshwater), characterized by pH (7.55), high content of SO42- (4162.99 mg/L), while other main metal ions detected were Mg (594.90 mg/L) and Ca (650.10 mg/L). It was observed that the prokaryotic biodiversity of the three wastewater lakes generally increased with increasing pH. The prokaryotic composition of the two acidic wastewater lakes was relatively close. However, lake TF was dominated by autotrophic iron oxidizing bacteria (69.54%±2.89%), while lake PT by heterotrophic bacteria (64.45%±13.81%). The ratio of autotrophic iron oxidizing bacteria
矿山废水是在矿山开采过程中产生的各种废水的总称。地下水渗流到矿井中,之后这些水被排放到地表,汇集在一起形成矿山废水;采矿过程中产生大量的矿山废石或尾矿,在露天堆放储存时,经过风化、雨水冲刷也可形成矿山废水[
按照矿山废水的酸碱度可以分为碱性矿山废水和酸性矿山废水[
中国安徽省东部某铁矿于20世纪初开始开采,开采过程中形成了大量矿坑。这些矿坑经过自然降水和人工排水,形成了大小不一的矿山废水库。这些矿山废水库中的废水经过下渗、漫流,严重污染环境,是中国矿山废水污染的典型案例。这些不同时期形成的矿山废水库,是研究矿山废水形成机制、微生物群落结构和功能演变过程的良好样本。因此本研究选择了3个不同时期形成的矿山废水库采集样品,研究了矿山废水中微生物多样性及群落结构的变化规律,进而探索了环境因子对微生物群落的影响。研究结果可以为控制矿山废水的产生及生物修复提供理论依据。
研究区域位于安徽省东部,属亚热带季风气候,年平均气温16 ℃,年降水量为1100 mm[
排土场废水库(PT)在TF废水库的东侧,直线距离大约相距2 km。该废水库形成于20世纪70年代,水库周边是该矿区主要废石堆放地。大量的含硫废矿石经风吹雨淋,经过一系列氧化反应形成酸性废水汇集到一起形成如今的废水库。该水库目前长约700 m,宽约300 m,总汇水面积约3 km2,水域面积约1.0×105 m2。
东沙采场废水库(DS)在TF废水库的西南约500 m。该废水库原为该矿区最早形成的大型采坑。经过长年采矿,矿石已经枯竭,现已闭坑十余年,目前用于储存尾矿浆。该废水库目前长约750 m,宽约590 m,水域面积约3.32×105 m2。
虽然这3个废水库直线距离很近,但由于形成时间和形成方式不同,所以物理化学参数有明显差异,是研究矿山废水中微生物群落结构和演变的良好样本。
本研究于2015年10月采集了这3个矿山废水库的表层水样。采样点距离库边大约50 cm,采集深度约为10–20 cm,采样点如
采样点位置图
Locations of sampling sites
用于测定TIC/TOC的样品在现场用0.45 μm的滤器过滤到棕色玻璃瓶中,并加入HgCl2进行生物灭活。用于其他物化指标测试的样品均过滤到聚乙烯瓶中,测定金属的样品加适量硝酸酸化。用0.22 μm的水系无菌滤膜过滤1000 mL的水样收集菌体,用于后续生物分析。所有的样品采集完成后都保存于4 ℃保温箱,并立即带回实验室进行分析。
水样的温度和pH利用哈纳水质测定仪(Hanna,Italy)现场进行测定,其他指标均在实验室测定。利用离子色谱仪(Thermo,USA)测定SO42–、Cl–,有机碳测定分析仪(Analytikjena,Germany)测定TIC/TOC,ICP (ICP-AES,Thermo,USA)测定金属元素[
利用MPBio FastDNA® DNA试剂盒提取水样DNA,提取后于–80 ℃冰箱保存。
用高通量测序引物F515 (5'-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3')和R806 (5'-GGACTACVSGGGT ATCTAAT-3')[
PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,若扩增片段符合要求,则用2%琼脂糖凝胶进行电泳跑胶,并将目的片段于紫外灯下切下,利用DNA凝胶回收试剂盒KitVer.2.0 (TaKaRa)进行纯化。扩增纯化后的样品送至上海美吉生物医药科技有限公司采用Illumina Miseq测序仪进行测序。
获得的高通量数据利用Mothur软件鉴定并去除低质序列和嵌合体,不同样品获得的高质量序列为15930–29496。为了减少由于不同测序深度引起的潜在偏差,统一测序深度为15900。用cluster命令得到相似性大于97%的OTU(operational taxonomic unit),再使用classify.seqs命令把代表性OTU与silva.na_v128数据库进行对比分析,置信度阈值为80%。用summary.single命令计算Shannon多样性指数。
http://www.r-project.org/)来实现的。使用R包gplots对不同样品中的属的相对丰度进行聚类和可视化。基于OTU相对丰度的Bray-Curtis距离,进行相似性分析(ANOSIM)比较不同样品的微生物群落。用Pearson相关系数来评价属组成与环境因子之间的关系和多样性指数与环境因子之间的关系,评价主要物理化学参数对微生物群落结构的影响。使用Mantel分析微生物群落结构与环境变量之间的关系。用Canoco 4.5计算各主要环境因子对原核微生物群落结构的影响。]]>
本文的序列已提交GenBank,登录号为SRR7958232–SRR7958237 (16S rRNA基因序列)、SRR8205360–SRR8205362 (18S rRNA基因序列)。
3个矿山废水库的物理化学性质差异明显(
样品物理化学参数
Physicochemical parameters of the samples
Sample | TF1 | TF2 | PT1 | PT2 | PT3 | DS |
pH | 2.54 | 2.55 | 2.97 | 2.92 | 2.93 | 7.55 |
24.37 | 23.06 | 21.13 | 22.39 | 22.62 | 25.55 | |
NH4+-N/(mg/L) | 2.29 | 2.38 | 2.94 | 3.48 | 2.78 | 2.79 |
TP/(mg/L) | 0.40 | 4.08 | 0.24 | 6.27 | 2.38 | 1.00 |
Fe2+/(mg/L) | 9.02 | 5.55 | 12.93 | 8.17 | 8.72 | 0.13 |
SO42–/(mg/L) | 3378.67 | 3371.06 | 9565.16 | 11076.06 | 10555.71 | 4162.99 |
Salinity/(g/L) | 5.54 | 4.95 | 13.37 | 14.62 | 14.40 | 6.32 |
Al/(mg/L) | 135.57 | 143.01 | 551.10 | 623.40 | 627.30 | 0.12 |
Ca/(mg/L) | 309.00 | 335.40 | 484.20 | 509.40 | 510.90 | 650.10 |
Cu/(mg/L) | 10.59 | 11.16 | 25.78 | 29.28 | 29.81 | 0.02 |
Fe/(mg/L) | 154.17 | 155.73 | 40.23 | 31.56 | 31.92 | 0.12 |
K/(mg/L) | 1.13 | 1.97 | 2.12 | 5.83 | 4.64 | 30.78 |
Mg/(mg/L) | 220.80 | 224.67 | 979.20 | 1178.10 | 1153.80 | 594.90 |
Mn/(mg/L) | 18.16 | 18.01 | 172.44 | 215.16 | 212.19 | 38.39 |
Na/(mg/L) | 20.29 | 22.18 | 29.14 | 35.55 | 33.51 | 97.98 |
Zn/(mg/L) | 2.11 | 3.08 | 7.90 | 10.20 | 10.23 | 0.03 |
TIC/(mg/L) | 4.63 | 0.54 | 2.04 | 0.27 | 0.6 | 11.65 |
TOC/(mg/L) | 0.7 | 0.45 | 0.87 | 0.67 | 0.67 | 1.67 |
废水库PT的pH值为2.9±0.02,比TF酸性要弱,Fe (34.57±4.00 mg/L)浓度明显低于TF,但SO42–含量远远高于TF,达到10398.98±626.70 mg/L,其他主要的金属离子Mg (1103.70±88.59 mg/L)、Al (600.60±35.04 mg/L)、Ca (501.50±12.25 mg/L)、Mn (199.93±19.48 mg/L)含量也明显比TF要高。
与上述两个酸水库不同,DS是一个中性矿山废水库,pH值为7.55;SO42–的浓度也高达4162.99 mg/L,介于PT和TF两者之间;主要金属离子为Mg (594.90 mg/L)、Ca (650.10 mg/L)。
可以看出,3个废水库中均含有高浓度的金属离子和SO42–。如此高浓度的阴阳离子,即使废水库中的废水不外溢,仅仅通过下渗以及地下水循环也会对周边农田以及居民饮用水造成严重的影响。
所有样品的菌群丰富度指数(Chao/Ace)、多样性指数(Shannon/Simpson)以及测序深度指数(Good’s Coverage)见
样品的α-多样性指数表
α-diversity index of the samples
Sample | OTUs | Good’s Coverage/% | Richness and diversity indices | |||
Ace | Chao | Shannon | Simpson | |||
TF1 | 293 | 99.01 | 886.70 | 584.57 | 1.56 | 0.46 |
TF2 | 277 | 98.86 | 1423.27 | 802.48 | 1.52 | 0.43 |
PT1 | 258 | 99.08 | 798.66 | 544.08 | 2.09 | 0.29 |
PT2 | 300 | 98.85 | 1232.32 | 888.25 | 2.70 | 0.12 |
PT3 | 299 | 98.91 | 1139.78 | 649.14 | 2.61 | 0.14 |
DS | 352 | 98.88 | 1229.46 | 710.02 | 3.78 | 0.04 |
在95400条有效序列中,仅有460条古菌序列,细菌在所有的样品中都占据绝对优势地位。β-变形菌门(
样品中主要原核微生物在门水平所占比例
Relative abundance of prokaryotic microbes phyla in the samples
以属作为分类单元来考察微生物群落组成,可以得到如
样品中主要原核微生物属水平所占的比例
Relative abundance of prokaryotic microbes genus in the samples
与原核生物相比,样品中的真核生物的群落结构简单。6个样品经过Mothur分析,主要得到3个已知门类:金藻门(
样品中的主要属所占的比例见
样品中真核微生物各属所占的比例
Relative abundance of eukaryotic genus in the samples
胶球藻属(
小环藻属(
微芒藻属(
将所有的环境参数与原核微生物的α多样性指数通过R语言Pearson计算方法计算其相关性,发现pH和钠(Na)与香农指数(Shannon Index)呈显著正相关,样品中的微生物多样性随pH的升高和Na浓度的增加而增加(
物化参数与Shannon指数的Pearson相关性
Pearson correlation between physicochemical parameters and Shannon index
对6个样品进行原核微生物群落组成的相似性(ANOSIM)分析显示,3个不同的废水库原核微生物群落结构明显不同(
通过R语言的Bioenv命令来寻找对微生物群落影响最大的环境因子组合。结果表明:pH、Na、K、Mn的组合与微生物群落之间的相关性最高,达到0.9899,贡献率达到98.43%,说明这四种环境参数对微生物群落变化有很大的影响。
用Canoco 4.5对环境参数和微生物群落分析后发现,pH、Na、K是对微生物群落结构影响最大的环境因子(
微生物群落组成和环境因素的典范对应分析(CCA)
Canonical correspondence analysis (CCA) between microbial community composition and environmental factors
本研究的3个矿山废水库,虽然距离非常近,但由于形成的时间和方式不同,所以它们的物理化学性质有明显的差异。酸水库TF形成于2013年左右,本身为未开采完成的矿坑,矿石中含有高品位的铁硫,极易发生氧化产生酸性矿山废水,所以TF的酸性最强。酸水库PT位于排土场中央,废矿石中铁硫的含量本来就低,又经过40多年的风化[
矿山废水理化性质的差异,导致水体中微生物群落存在明显差异[
从统计学分析结果可以看出,pH是影响废水原核微生物群落结构和多样性最重要的环境因素。除pH外,Na和K也对微生物的群落组成和多样性有明显的影响。Na和K是微生物生长的重要营养元素,在维持细胞渗透压等方面发挥着关键的作用。在酸性环境中,Na和K还可帮助嗜酸菌维持中性的细胞内环境。目前已知所有嗜酸微生物细胞质pH都接近中性,很多微生物可以在细胞膜内侧累积高浓度的Na/K来抑制细胞外高浓度的H+的流入[
pH对废水库中真核微生物群落的影响同样巨大。酸性废水库中主要分布有两种嗜酸藻类,胶球藻属(
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